【目的】：研究三七和天麻对神经干细胞(neuronal stem cells, NSCs)分化的影响以及蛋白质组学变化,为探讨NSCs分化的蛋白分子机制提供实验依据。【方法】：体外培养E10-12d ICR胎鼠海马神经元,原代培养1周后,进行Nestin染色鉴定,将神经球进行传代培养,随机分成6组：无血清组、血清组、三七组、天麻组、三七血清组和天麻血清组。各组于传代培养7天后取材,进行Tuj1和GFAP免疫染色检测细胞分化；运用ImageJ软件计数神经球、阳性细胞数量、测量神经球、阳性细胞大小和神经球、阳性细胞突起长度,探讨干预措施对NSCs生长、增殖和分化的作用。然后应用双向电泳、串联质谱分析和生物学技术调查了血清组、三七血清组和天麻血清组的蛋白质组学变化,了解NSCs生长、增殖和分化的分子机制。【结果】：1. NSCs形态学鉴定结果：体外NSCs成球形悬浮生长,Nestin染色鉴定为阳性,证明细胞为NSCs。2.在无血清条件下,显微镜下观察显示：三七和天麻干预后,神经球明显减少,表明三七、天麻可能抑制了NSCs克隆球的形成。然而,NSCs球体面积增大,突起增加,表明三七、天麻可能促进了已形成神经球的生长。免疫组化染色显示：Tuj1染色阳性细胞数量没有统计学意义,但是阳性细胞面积增大,突起长度增加；GFAP染色阳性细胞数量和突起长度无统计学意义,然而阳性细胞面积明显增大。免疫组化染色结果显示了三七和天麻在无血清培养下可能主要是促进已分化的神经元样细胞与星形胶质样细胞的生长。3.血清处理后,较多NSCs开始贴壁,神经球数量明显减少,球体面积增大,突起长度增加,这表明血清可能抑制了神经球的形成,但是促进了已形成神经球的生长；免疫组化染色显示：Tuj1染色阳性细胞数量明显减少,阳性细胞百分数由无血清的24.6%降低到23.6%,细胞面积增大,突起长度增加；GFAP染色阳性数量明显增加,阳性细胞百分数由无血清的33.4%上升到45.6%,细胞面积增大,突起长度无统计学意义。免疫组化结果说明了血清处理后NSCs可能主要向星形胶质样细胞分化。此外,血清还促进了已分化的星形胶质样细胞和神经元样细胞的生长。4.在有血清条件下,三七和天麻干预后,显微镜下观察,神经球数量减少,球体面积减少,突起长度无统计学意义。免疫组化染色显示：Tuj1阳性细胞数目增加,细胞面积增大,突起长度无统计学意义；GFAP阳性细胞数目、细胞面积和突起长度均无统计学意义。这些说明三七和天麻在血清存在的情况下抑制了NSCs神经克隆球的形成,但明显促进其贴壁分化,且主要分化为神经元样细胞。5.蛋白组学结果显示：无血清组、血清组、三七血清组和天麻血清组分别检测到320、230、287和181个蛋白点。这些蛋白点主要分布在PH4-9的等电点范围内,相对分子量在10-90KD之间。组间比较共检测到14个差异蛋白点,并进行后续的质谱分析与鉴定。(1)血清组与无血清组比较：共检测到了5个差异蛋白点,其中1号蛋白点为新增点、2号为缺失点、3号点含量增加、4和5号点含量减少。(2)三七血清组与血清组比较：共检测到了7个差异蛋白点,其中2和6号蛋白点为新增的、7号蛋白点缺失、8-11号蛋白点为量增加的。(3)天麻血清组与血清组比较：共检测到了5个差异蛋白点,其中1、12、13号蛋白点缺失、14号点含量增加、8号点含量减少。6.串联质谱技术检测结果显示：14个差异蛋白点获得肽指纹图谱和串联质谱分析。将质谱分析结果在Mascot数据库检索鉴定蛋白。因天麻血清组与血清组比较的第2个蛋白点即12号点没检测出来,所以质谱分析共鉴定了13个蛋白,分别为：血清白蛋白前体、肿瘤拒绝抗原或热休克蛋白90、血清白蛋白前体、非肌源性的原肌球蛋白、核仁磷酸蛋白、二氢嘧啶酶、乳酸脱氢酶2-B链、78KD糖调节蛋白前体、二氢嘧啶酶、坍塌反应调节蛋白、肌球蛋白绑定蛋白、伴侣蛋白5、三磷酸苷油醛脱氢酶。【结论】：1.本实验成功地培养了NSCs,并对其进行分离与鉴定。血清促进NSCs向星形胶质样细胞分化。三七和天麻在无血清条件下,主要是促进已分化的神经元样细胞与星形胶质样细胞的生长；在有血清条件下,主要是促进NSCs向神经元样细胞分化。2.建立了NSCs分化过程中的双向电泳技术,并用该技术成功对血清诱导NSCs分化为星形胶质样细胞的过程中的蛋白质进行了分离和鉴定,为探讨血清诱导NSCs分化的蛋白组学机制提供实验依据。在血清组检测到了血清白蛋白前体、肿瘤排斥抗原或热休克蛋白90、血清白蛋白前体、非肌源性原肌球蛋白和核仁磷酸蛋白5个差异表达的蛋白。这些差异蛋白主要涉及免疫调节,蛋白质的合成、能量代谢、细胞骨架成分、应激反应等生物学功能。3.调查了血清存在条件下三七、天麻对NSCs分化过程的蛋白质组学变化,为探讨中药干预下NSCs分化的蛋白组学机制提供实验依据。在三七血清组发现了肿瘤排斥抗原或热休克蛋白、二氢嘧啶酶、乳酸脱氢酶2-B链、78KD糖调节蛋白前体、二氢嘧啶酶,崩塌反应调节蛋白和肌球蛋白绑定蛋白7个差异表达的蛋白,它们主要涉及细胞与组织的应激反应、免疫调节、细胞的存活与凋亡、信号转导、蛋白的物质代谢及抗凋亡和细胞的连接与运动等生物学功能；在天麻血清组发现了血清白蛋白前体、78KD糖调节蛋白前体、伴侣蛋白5和三磷酸苷油醛脱氢酶4个差异表达的蛋白,这些蛋白主要涉及了物质与能量代谢、蛋白质折叠、蛋白质催化、凋亡与抗凋亡和抗氧化等生物学功能。