结核病是由结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌等所引起的人、畜、禽及伴侣动物的一种慢性传染病,近年来,结核病已成为仅次于艾滋病的第二大致死性疾病。一直以来,人类及畜牧业生产中的结核病给予了较多的关注,但在犬猫等伴侣动物上,结核病尚未得到充分的重视。而犬猫结核病多为亚临床表现,易与其他呼吸道疾病混淆,一旦感染,易出现漏诊和误诊现象,从而使患犬成为人类最隐蔽、接触最为密切的传染源。基于犬猫结核病研究的重要性和紧迫性,本研究利用建立的荧光定量PCR方法对上海地区部分犬猫进行了分子流行病学调查,并积极探讨了药物治疗和免疫治疗犬猫结核的新型途径和手段,这将对犬猫结核病的有效防治具有一定的指导意义。1 SYBR Green荧光定量PCR检测犬猫结核方法的建立本研究以IS1081基因片段作为待检基因,建立了鉴定犬结核的SYBR Green荧光定量PCR方法。根据熔解曲线分析,扩增产物中无引物二聚体,说明所设计引物特异、退火温度适宜。筛选获得最佳反应条件:反应效率为1.09,获得的标准曲线相关系数R值达0.9995,标准曲线的线性范围达到1～1×107拷贝8个数量级,最低可检测到约10个目的拷贝DNA,灵敏度可达31.4fg。对20份痰液(固体培养鉴定为分枝杆菌阳性)进行检测,有19份阳性临床样本被检测为阳性,符合率达95%。这表明本研究建立的SYBR Green荧光定量方法检测灵敏度高、特异性强、定量范围广。2犬猫分枝杆菌感染的分子流行病学调查从上海市不同区县采集352份犬猫鼻液、痰液、尿液及宠物饲料样品进行检测,以16s rRNA、IS6110、Rv3878、IS1081、ESAT-6和CFP-10等为目的基因设计引物,结果显示:非健康犬猫样品DNA中,ESAT-6和CFP-10基因检出率分别为43%和38.6%,对应的16s rRNA基因符合率仅为7%～8%,而致病性分枝杆菌特异的引物:TB27.4、IS6110和IS1081基因不能被检出;而在健康犬猫样品DNA中,所有基因的检出率均很低。本研究结果表明,健康犬猫可能携带有大量非典型分枝杆菌,而且罹病犬猫被非典型分枝杆菌感染的几率较健康犬猫更大。3 CFP-10/ESAT-6融合蛋白诱导IFN-γ产生的初步研究以牛分枝杆菌强毒株DNA为模板,扩增获得CFP-10和ESAT-6基因,利用疏水性氨基酸(Gly4Ser)3为Linker,将两个蛋白融合表达于pET32a(+)载体中,并再ESAT-6的C端连接HIV Tat的蛋白转导域,得到的两种融合蛋白表达载体分别命名为:pCE106、pCET。将上述载体转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导,获得CET和CE106可溶性融合蛋白,将其分别免疫小鼠制备多抗,经重组杆状病毒检测为免疫荧光阳性反应。将上述抗原免疫Km系小鼠,4免后,取脾脏,分离淋巴细胞,利用CFP-10(1-18aa)、ESAT-6(1-16aa)多肽为刺激物,采用ELISPOT法检测IFN-γ分泌水平。结果显示:上述融合蛋白并可诱导低剂量的IFN-γ产生,但差异并不显著。4结核杆菌泛酸激酶的原核表达及纯化泛酸激酶(CoaA)是泛酸(CoA)合成的关键性调节酶,可以用拟胆碱药物通过竞争性抑制泛酸激酶的活性从而达到抑菌目的。本试验克隆表达了牛分枝杆菌和鸟分枝杆菌的泛酸激酶基因(coaA),将其连接到pET32a(+)载体中进行原核表达。结果显示:鸟分枝杆菌泛酸激酶呈现可溶性表达,而牛型分枝杆菌却呈包涵体形式。随后,通过His纯化试剂盒纯化获得鸟分枝杆菌泛酸激酶的原核表达产物。该一研究为进行泛酸激酶酶活性测定、突变酶活性位点、开发抗结核药物等研究工作奠定了一定的基础。