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研究目的在不同实验研究中,Aβ1-42使用浓度参考值存在着较大的差异。不同的实验中Aβ1-42寡聚体、原纤维及纤维的制备方法并不一完全致。Aβ1-42寡聚体、原纤维及纤维的制备方法主要包括以下六个步骤:六氟异丙醇(hexafluoroisopropanol,HFIP)单体化Aβ1-42冻干粉、干燥去除HFIP、DMSO助溶、培养基稀释、去除Aβ1-42溶液中杂质以及孵育。而各个文献方法部分主要差异在于干燥去除HFIP的步骤及去除Aβ1-42溶液中杂质的步骤。本研究旨在改进Aβ1-42寡聚体、原纤维及纤维的制备方法,对成品进行检测以评估改进方法的可行性。同时比较Aβ1-42寡聚体、原纤维及纤维的神经毒性差异,以为AD的实验研究提供依据。研究方法1.参考真空冷冻干燥仪及自然挥发干燥去除HFIP的原理和机制,设计简易负压低温干燥装置。2.在去除Aβ1-42溶液杂质步骤前后,分别留取了三组母液。以下为三组母液的分组:A组,去除杂质前母液;B组,过滤法去除杂质后的母液;C组,超速离心法去除杂质后的母液。根据大鼠β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)ELISA Kit说明书进行Aβ浓度检测。3.蛋白质印迹(Western Blot,WB)分析检测自然挥发干燥+4℃ 24h孵育、简易负压低温干燥装置+4℃ 24h孵育,以比较自然挥发干燥与简易负压低温干燥装置制备得到的Aβ1-42寡聚体区别。4.对简易负压低温干燥装置制备的Aβ1-42母液,分别按4℃ 24h、37℃ 24h、37℃ 7d的温度时间条件进行孵育,得到的Aβ1-42寡聚体、原纤维及纤维成品进行WB检测及电子显微镜观察,以评估改进方法的可行性。5.体外神经元原代培养,并利用免疫荧光法鉴定神经元原代,以评估神经元原代纯度。6.分别以1、5、25μmol/L浓度的Aβ1-42寡聚体、原纤维及纤维成品对神经元作用24h后,普通光学显微镜下观察神经元形态。再利用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测法和CCK8细胞活力检测法检测原代神经元细胞的细胞活性,以评估改进方法制备的Aβ1-42寡聚体、原纤维及纤维成品的生物效价,同时比较Aβ1-42寡聚体、原纤维及纤维毒性差异。研究结果1.设计了简易负压低温干燥装置。利用具有单向气阀的密封容器、负压抽吸机及恒温冰箱的简易负压低温干燥装置,能够有效控制干燥去除HFIP的条件。2.ELISA结果显示,在Aβ1-42寡聚体、原纤维及纤维制备过程中,经过过滤或离心操作后,Aβ1-42存在丢失,而且过滤法丢失量小于离心法。3.半定量分析使用自然挥发干燥+4℃ 24h孵育和使用简易负压低温干燥装置+4℃ 24h孵育得到的Aβ1-42成品的WB条带,对比分析单体、寡聚体、原纤维和纤维区域灰度值占全区域灰度值百分比发现,使用简易负压低温干燥装置具有更高的寡聚体百分比。4.用简易负压低温干燥装置制备的得到Aβ1-42成品通过WB检测及透射电子显微镜下观察。Aβ1-42寡聚体、原纤维和纤维成品符合Aβ寡聚体、原纤维和纤维特征。结果提示改进方法能成功制备得到的Aβ1-42寡聚体、原纤维及纤维。5.神经元原代鉴定结果,神经元纯度≈95%,本研究制备的神经元原代具有较高纯度,符合后续体外实验要求。6.LDH和CCK8结果提示,Aβ1-42寡聚体、原纤维及纤维均存在神经毒性作用,且具有浓度依懒性。寡聚体毒性>原纤维毒性>纤维毒性。在本研究使用的制备方法中,推荐Aβ1-42使用浓度为5μmol/L。结论1.在Aβ1-42寡聚体、原纤维及纤维的制备过程中,使用简易负压低温干燥装置代替自然挥发干燥HFIP能更好的控制和记录干燥条件,以增加实验的可重复性。2.在去除Aβ1-42溶液中杂质步骤中,使用过滤法代替原有的超速离心法能有效减少Aβ1-42损耗,节约成本。3.使用HFIP简易负压低温干燥装置代替自然挥发,以及使用过滤法代替原有的超速离心法去除Aβ1-42溶液中杂质的改进方法能成功制备得到Aβ1-42寡聚体、原纤维及纤维。4.Aβ1-42寡聚体、原纤维及纤维对原代神经元细胞存在毒性具有浓度依懒性。证明了改进方法制得到Aβ寡聚体、原纤维及纤维都具有生物学效应。寡聚体毒性>原纤维毒性>纤维毒性。本研究的改进方法推荐Aβ使用浓度为5μmol/L。