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卵巢早衰(Primary ovarian failure,POF)也称早发性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency,POI),是指在四十岁以下的女性卵巢缺乏功能性卵泡而导致性腺功能下降,其促性腺激素升高和雌激素下降,并出现月经稀发或闭经的一些围绝经期症状。据报道,在四十岁之前,卵巢功能不全的发病率为1%,在三十岁前为0.1%。自1968年首次提出POI与自身免疫性疾病有关,近年来,研究结果表明自身免疫性因素约占POI病例的4-30%。目前治疗卵巢功能不全的手段有限且效果不佳,寻找安全有效的治疗策略有着重要意义。CD4~+CD25~+调节性T细胞(Treg)是一群维持机体免疫平衡的淋巴细胞,通过抑制效应T细胞和分泌TGF-β发挥免疫抑制作用。Treg细胞数量的减少以及功能损害都会破坏自身免疫机制,从而引起过度免疫反应,导致自身免疫性疾病的发生。我们已发现卵巢功能不全患者体内外周血中CD4~+CD25~+Treg细胞数量的减少和T细胞亚群的失衡可能是POI的发病机制。小鼠过继性回输CD4~+CD25~+Treg细胞后增加POI模型鼠体内Treg细胞数量、调节T淋巴细胞比例,能有效改善因胸腺摘除(D3tx)导致的自身免疫性卵巢炎。本研究以小鼠透明带3多肽片段(pZP3)免疫BALB/c小鼠建立免疫性POI动物模型,探索在不同免疫损害背景下,CD4~+CD25~+Treg细胞对小鼠卵巢功能不全的治疗作用。研究内容如下:1、免疫性卵巢功能不全模型小鼠的建立。根据小鼠透明带3第330-342位的氨基酸序列(NSSSSQFQIHGPR)合成多肽,纯度95%以上的p ZP3冻干粉溶解于双蒸水配成浓度为50 nmol/L溶液后与等体积完全弗氏佐剂(CFA)乳化,选择6-8周雌性BALB/c小鼠于腹部、脚趾等皮下注射总量0.1ml乳化液,两周后等量pZP3溶液与不完全弗氏佐剂(FIA)乳化后再次皮下注射加强免疫,末次免疫一周后可用于实验检测研究。每天早上8:00-9:00对正常小鼠和模型小鼠进行阴道涂片法观察两组小鼠动情周期变化,连续观察2周;酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中抗透明带抗体(AZPAb)的浓度以及血清中雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、抗缪勒管激素(AMH)的变化;观察卵巢形态及组织学变化并对各级卵泡进行计数;免疫组化法检测卵巢组织中淋巴细胞浸润情况以及凋亡相关蛋白BAX、BCL-2、CASPASE3的表达;利用Real-time PCR和Western Blot检测卵巢中TGF-β/Smads信号通路、PI3K/AKT/FOXO3a信号通路、Hippo信号通路相关分子的表达情况。研究结果:1、pZP3模型组小鼠无明显动情期;与正常对照组比较,pZP3模型组血清中AZPAb、FSH、LH浓度明显升高,E2、AMH浓度降低(P<0.05)。2、pZP3模型组小鼠的卵巢组织体积较小,颜色为白色或浅粉色,表面光滑,呈小球状,而对照组的小鼠卵巢组织呈粉红色且表面伴有大小不等的透明凸起,其卵巢组织重量也显著高于pZP3模型组。3、HE染色结果显示对照组的卵巢形态结构完整规则,各级卵泡发育良好、清晰可见且数量较多,而pZP3模型组卵巢形态结构紊乱,各级卵泡形态不规则且数量明显减少,甚至无明显卵泡。通过对各级卵泡计数统计发现,pZP3组中的原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡均显著减少,闭锁卵泡明显增加,两组比较均有统计学意义。4、pZP3免疫后,卵巢组织中CD3,CD19阳性淋巴细胞表达明显增强,显示卵巢组织中淋巴细胞浸润增多,炎症反应增加;卵巢组织中BAX、CASPASE3表达增加、BCL-2表达减少,表明卵巢组织中细胞凋亡增加。5、Real-time PCR和Western Blot结果显示,pZP3免疫后卵巢组织中TGF-β/Smads信号通路相关分子TGF-β、Smad2、Smad3表达降低、PI3K/AKT/FOXO3a信号通路分子Pi3k、Akt、FOXO3a表达增加,Hippo信号通路关键分子Mst1/2、Lats1、Yap/Taz、Sav1表达上调。2、CD4~+CD25~+Treg细胞治疗小鼠免疫性卵巢功能不全的研究:选择8周龄健康雌性BALB/c小鼠,利用磁珠分选法分选脾脏组织中CD4~+CD25~+Treg细胞,并用流式细胞仪检测,其纯度达93.2%。将分离的5x10~5 CD4~+CD25~+Treg细胞经腹腔过继回输到pZP3免疫的POI小鼠体内,4周后,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中AZPAb、FSH、LH、E2、AMH水平变化;HE染色观察卵巢的组织学变化并对各发育阶段的卵泡进行计数;免疫组化法检测卵巢组织中BCL-2、BAX、CASPASE3的表达;利用带有红色荧光蛋白的td-Tomato-Treg细胞来定位移植后Treg细胞在POI小鼠体内的归巢情况。Real-time PCR检测卵巢组织中TGF-β/Smads信号通路、PI3K/AKT/FOXO3a信号通路、Hippo信号通路关键分子的表达情况。研究结果:1、CD4~+CD25~+Treg细胞过继回输后,小鼠血清中的AZPAb浓度、FSH、LH水平降低,E2、AMH升高;卵巢组织重量增加,淋巴细胞浸润减少,可见少许发育卵泡且卵泡数量有所增加。2、凋亡相关蛋白BAX、CASPASE3表达降低,BCL-2表达升高。3、CD4~+CD25~+Treg细胞回输24h、48h后,可见卵巢组织间质区域出现红色荧光。4、Real-time PCR结果显示CD4~+CD25~+Treg细胞回输后,下调卵巢组织中PI3K/AKT/FOXO3a关键分子AKT,FOXO3a分子的表达,TGF-β/Smads信号通路、Hippo信号通路相关分子无显著差异。综上所述,pZP3免疫BALB/c小鼠产生了与人类POI相似特征,血清中自身抗体增加,卵巢组织中T、B细胞浸润增加,卵巢结构紊乱,卵泡数量减少。pZP3免疫引起的POI可能由于自身抗ZP3抗体攻击卵母细胞透明带导致卵泡数量减少,并使卵巢组织中细胞凋亡增加以及PI3K/AKT/FOXO3a信号通路分子AKT、FOXO3a和Hippo信号通路分子Mst1/2、Lats1、Yap的表达上调,TGF-β/Smads信号通路分子TGF-β、Smad2、Smad3的表达下调。CD4~+CD25~+Treg细胞回输24h、48h后可归巢于小鼠卵巢间质区域,而且有效改善早发性卵巢功能不全小鼠血清中抗透明带抗体浓度以及性激素水平,下调卵巢内凋亡相关蛋白的表达,降低PI3K/AKT/FOXO3a信号通路关键分子AKT、FOXO3a的表达,从而改善小鼠卵巢功能,为临床上探索POI的新兴治疗方式提供实验基础。