研究目的：RNA干扰(RNAi)是植物和低等动物体内发挥防御内源性核酸的比较保守的机制。内源性的RNAi通路主要通过siRNA和miRNA两个途径发挥作用,而miRNA主要是基因组中非完全匹配的非编码RNA。目前,RNAi已被广泛应用于抗HBV研究中,并在体内外实验中证实能够明显抑制HBV的复制和表达。随着研究的深入,人们发现某些siRNA具有免疫激活作用,能被胞内固有免疫受体所识别。机体天然免疫系统主要通过TLRs、PKR、RIG-I等介导对siRNA的识别,进而活化NF-κB、MAPK、IRF-7等信号通路,诱导干扰素和炎性因子的产生。X基因(HBx)是多功能HBV序列的代表,其编码的X蛋白是所有转录本均具有的保守序列,因此,是进行基因治疗的理想靶标。在HBV所引起的慢性乙型肝炎的发病机制中,既有病毒的始动作用,又有机体固有免疫和获得性免疫的功能不足,肝脏中HBV的持续存在可抑制TLRs、RIG-I等介导的天然免疫应答,此亦成为HBV持续性感染进一步加重肝脏免疫耐受、影响HBV临床治疗效果的原因之一。因此,对慢性乙肝的治疗要求兼顾抑制病毒和增强免疫功能。降低HBV负荷的同时提高肝脏微环境中天然和获得性免疫应答能力可能会纠正或逆转HBV导致的免疫耐受。本研究的目的是通过设计靶向HBx基因的5’-triphosphate-siRNA (3p-HBx-siRNA)和化学合成siRNA(HBx-siRNA),观察该siRNA能否既发挥特异性的靶基因沉默作用,又能够激活天然免疫相关信号通路,从而改善HBV导致的免疫耐受状态。研究方法：首先,我们以携带HBV全基因组的HepG2.2.15细胞为模型,观察转染3p-siRNA对HBV表达和复制的影响及免疫刺激作用。用RT-qPCR的方法检测了HBx基因和HBs/p基因的表达；用ELISA的方法检测了HepG2.2.15细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量变化。在免疫刺激作用方面,用RT-qPCR的方法检测了IFN-α、IFN-β、ISG15和ISG56的mRNA表达水平；通过Western blotting检测p42/p44 MAPK信号通路的活化,以及NF-κB信号通路中IKB的蛋白降解水平；应用萤光素酶报告基因实验观察3p-HBx-siRNA对IFN-β的启动子序列的调控。另外,我们比较了HepG2和HepG2.2.15细胞表达相关细胞因子的差别,发现感染HBV的HepG2.2.15细胞中,RIG-Ⅰ和干扰素相关基因表达相对较低；HepG2细胞对poly I：C刺激的免疫应答效应更为明显,而HepG2.2.15的反应相对比较迟钝。这表明,相对于无HBV感染的HepG2细胞,HepG2.2.15细胞处于免疫抑制状态。而3p-HBx-siRNA对RIG-Ⅰ信号通路的活化能够有效逆转这种免疫耐受状态。通过RIG-Ⅰ的过表达以及沉默实验,我们进一步证实,3p-HBx-siRNA能够通过活化RIG-Ⅰ信号通路进而增强对HBV复制的抑制作用。其次,我们将化学合成的siRNA转染到HepG2.2.15细胞中,进一步验证了靶向HBx基因的HBx-siRNA对HBV的抑制作用,用RT-qPCR的方法检测HBx基因以及HBV s/p基因的表达；用ELISA的方法检测了HepG2.2.15细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量变化；通过Western Blotting技术观察了HBx-siRNA对HepG2.2.15细胞中PKR信号通路的活化作用,用RT-qPCR的方法检测了IFN-α、IFN-β、ISG15和ISG56的mRNA表达水平；通过PKR的过表达实验和抑制实验,观察了胞内干扰素相关基因的变化,并检测了对HBV复制的影响。最后,我们通过尾静脉高压注射HBV质粒的方式建立小鼠HBV感染模型。一方面,通过灌流法分离小鼠肝实质细胞,然后转染HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA,观察其对HBV的抑制作用和免疫激活作用。另一方面,在HBV感染小鼠体内进行HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA的治疗,观察其在小鼠体内的免疫激活作用和HBV抑制作用。用放射免疫方法比较了血清中HBsAg和HBeAg的含量变化；用免疫组化的方法检测了胞内HBcAg的表达；用ELISA法检测了小鼠血清中IFN-α、IFN-β,以及免疫抑制因子TGF-β和IL-10的含量；用流式细胞术检测了不同淋巴细胞亚群CD69和NKG2D的表达。结果一体外试验证实5’-triphosphate-siRNA能够逆转HBV免疫耐受1.5’-triphosphate-siRNA的体外转录以及鉴定利用T7 RNA聚合酶的体外转录方法,我们成功获得了靶向HBx基因的5’-triphosphate-siRNA (3p-HBx-siRNA),其序列和化学合成的siRNA相同,见表1和表2。我们还设计了靶向GAPDH以及无关序列的3p-siRNA,即3p-GAPDH-siRNA和3p-scramble-siRNA。2.非特异性3p-siRNA能够序列非依赖性引起免疫激活作用将靶向GAPDH和scramble的3p-siRNA转染HepG2.1.15细胞,检测干扰素相关基因的表达,发现其能激活RIG-Ⅰ通路并诱导干扰素等细胞因子的表达,并在一定程度上抑制HBV的复制。3.化学合成的siRNA的抗HBV和免疫激活效应化学合成的HBx-siRNA能够显著抑制HBV的复制,但其对Ⅰ型干扰素的诱导能力比较弱,诱导倍数在4-6倍左右。4.3p-HBx-siRNA的‘’off-target"免疫刺激效应靶向HBx基因的3p-HBx-siRNA能够被胞内RIG-Ⅰ所识别,进而活化下游NF-κB和MAPK信号通路,从而诱导Ⅰ型干扰素和促炎症因子的表达,并下调免疫抑制因子IL-]0和TGF-β的表达。5.双功能3p-HBx-siRNA优于单纯具基因沉默作用的HBx-siRNA兼具免疫激活作用和直接HBx沉默作用的3p-HBx-siRNA能够更加有效地抑制HBx、HBV s/p基因的表达,以及上清中HBsAg和HBeAg的分泌,其抑制HBV的效果要明显优于化学合成HBx-siRNA。6.3p-HBx-siRNA逆转HBV免疫耐受携带HBV全基因组的HepG2.2.15细胞本身处于免疫耐受的状态,且对于polyI:C诱导的应答反应亦不如HepG2细胞敏感。靶向HBx基因的3p-HBx-siRNA不仅能够抑制HBV的复制,还能够激活RIG-Ⅰ免疫信号通路,进一步逆转HBV诱导的免疫耐受。7.3p-HBx-siRNA的免疫刺激作用和RIG-Ⅰ介导的Ⅰ型干扰素有关过表达RIG-Ⅰ后,3p-HBx-siRNAs的HBV抑制作用更为显著,并且能够增强免疫激活作用；RIG-Ⅰ的沉默后,3p-HBx-siRNAs对HBV的抑制作用明显削弱。这些结果进一步表明,RIG-Ⅰ信号通路活化与HBV抑制有关。而用IFNR1中和抗体将干扰素信号通路阻断后,3p-HBx-siRNAs对HBx基因的抑制作用明显削减。结果二化学合成的HBx-siRNA能够通过激活PKR信号通路进一步抑制HBV的复制1. HBx-siRNAs抑制HBV的表达化学合成的HBx-siRNAs不仅能够沉默HepG2.2.15细胞HBx基因的表达,还能抑制HBcAg的表达,降低HBsAg和HBeAg的水平,并且这种抑制HBV的效果具有siRNA浓度依赖关系。2. HBx-siRNAs诱导免疫应答反应在HepG2.2.15细胞中,化学合成HBx-siRNA可以诱导干扰素效应,并且其诱导效果随siRNA转染浓度的升高而增强；HBx-siRNA在诱导干扰素效应的同时,还能引起炎症因子的分泌；其对趋化因子CXCL2、CCL4、CXCL10的表达并没有显著影响。3. HBx-siRNAs能够诱导PKR以及下游信号通路的活化在HepG2.2.15细胞中,化学合成HBx-siRNA可以诱导PKR表达；Western Blotting结果显示,胞内PKR的磷酸化程度增强,并且能明显促进PKR底物eIF-2a的磷酸化；这些结果显示,PKR可能介导了HBx-siRNA所诱导的免疫激活作用。4.PKR介导HBx-siRNAs诱导的免疫应答和转染对照质粒组相比,HepG2.2.15细胞转染HBx-siRNAs后,过表达PKR可进一步促进IFN-αα和IFN-p mRNA水平的升高。而用2-AP抑制PKR活性后,干扰素和抗病毒基因的表达受到明显影响。结果提示,PKR的确参与了HBx-siRNAs引起的天然免疫应答。5.进一步确认PKR活化对于HBV的抑制作用我们将PKR过表达质粒以及对照质粒转染HepG2.2.15细胞,进而分析HBV表达的变化,结果发现HBx和HBs/p表达水平降低,表现出更加显著的抗HBV效果。而用2-AP抑制PKR后,HBx-siRNA对HBV的抑制效果明显削减。这些结果说明,PKR的活化能够有效抑制HBV的复制。结果三HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA逆转HBV免疫耐受的体内效应1.HBV持留续存(免疫耐受)小鼠模型的建立通过尾静脉高压注射的方式成功建立了HBV慢性感染模型,HBV感染比例大约为80%左右。2.3p-HBx-siRNA对HBV免疫耐受小鼠肝实质细胞的抗病毒效应胶原酶灌流法提取分离HBV慢性感染小鼠体内肝实质细胞；HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA均能抑制HBV基因的表达,从而抑制HBV的复制；均能明显上调RIG-Ⅰ的表达和Ⅰ型干扰素的产生。3.双功能3p-HBx-siRNA对HBV免疫耐受小鼠肝实质细胞的HBV抑制效应HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA转染小鼠肝实质细胞可明显抑制HBx和HBsAg的基因表达,降低血清中HBsAg和HBeAg的水平,抑制胞内HBcAg的表达,而以3p-HBx-siRNA的作用更明显。4. HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA在HBV免疫耐受小鼠体内的免疫激活效应HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA均能明显诱导HBV免疫耐受小鼠IFN-α和IFN-β的分泌,降低血清中TGF-β和IL-10的含量。HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA治疗对小鼠肝脏和脾脏淋巴细胞的比例并没有显著影响；3p-HBx-siRNA治疗可明显增强肝脏T细胞、NKT细胞CD69的表达；HBx-siRNA能明显上调肝脏T细胞和脾脏NK细胞CD69的表达；3p-HBx-siRNA治疗可略提高肝脏NKT细胞和NK细胞NKG2D的表达,而HBx-siRNA组并无明显变化。5.肝损伤的检测HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA进行高压注射治疗不会影响小鼠血清中ALT和AST转氨酶的水平；HE染色结果显示肝脏组织结构正常,无坏死灶,说明HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA治疗虽然激活天然免疫应答但并不引起明显肝损伤。结论及意义：1、首次设计出兼具靶基因沉默作用和免疫激活作用的3p-HBx-siRNA,并应用于抗HBV的治疗,发现这种双功能的siRNA较化学合成的siRNA具有更好的HBV抑制和病毒清除效果。2、3p-HBx-siRNA在通过活化RIG-Ⅰ信号通路诱导干扰素和抗病毒蛋白的产生,还能诱导TNF-αα等抗炎因子的表达,抑制TGF-β、IL-10等免疫抑制性因子的产生从而有效逆转HBV所致的免疫耐受。3、化学合成的HBx-siRNA可通过活化PKR信号通路激活肝细胞天然免疫应答,诱导干扰素和抗炎因子的产生,更加有利于siRNA对HBV的抑制和清除。这种兼具靶基因沉默作用和免疫激活作用的双功能siRNA具有在降低HBV负荷的同时提高肝脏微环境中天然和获得性免疫应答能力,并进而纠正HBV导致的免疫耐受的独特优势,将为HBV慢性感染,尤其是乙肝免疫耐受,提供新的治疗策略和思路。