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肝纤维化（hepatic fibrosis,HF）是在各种慢性损伤的情况下发生的持续性病理性损伤-修复过程,可导致细胞外基质（extracellular matrix,ECM）异常沉积,进而引发肝脏结构和功能的改变,最终可引起肝硬化甚至肝癌。对于肝纤维化目前还没有好的治疗药物和手段。研究表明,异常沉积的ECM的主要来源之一是活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）,HSC的活化增殖被认为是肝纤维化发生发展的中心环节,这一过程可受到多种细胞因子和信号通路的调节。通过抑制HSC的活化和增殖可以有效的抑制肝纤维化并达到治疗肝纤维化的作用。本实验室前期研究发现,橙皮素衍生物7号化合物（HDND-7）可通过抑制HSC活化增殖而发挥抗肝纤维化的作用。橙皮素（hesperitin）来源于芸香科柑橘属果实的果皮,是一类天然的黄酮类化合物。有文献报道,橙皮素具有抗炎,抗肿瘤,抗过敏以及抗氧化等生物活性。本实验室前期对橙皮素进行结构修饰合成了一系列的衍生物,其中的橙皮素衍生物11号化合物（HD-11）对TGF-β1诱导的大鼠肝星状细胞株HSC-T6的增殖具有明显的抑制作用,但HD-11是否具有抗肝纤维化的作用尚不明确;实验还发现,HD-11可促进PTEN的表达。大量文献报道,第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）在各种细胞的生长、增殖和凋亡等生理过程中发挥了重要的作用。PTEN作为一种抑癌基因,其合成的蛋白质广泛参与了人类各种癌细胞的增殖,如乳腺癌,直肠癌,肝癌等。此外,PTEN在其他疾病中的作用已被人们发现,如肝纤维化,肥胖,自身免疫性疾病等。前期研究还发现PTEN在肝纤维化过程中表达被抑制,升高PTEN能够抑制α-SMA和col1α1等肝纤维化指标的表达。已有文献报道,AKT作为PTEN的直接下游靶点,激活后可通过各种信号通路影响细胞的增殖和凋亡。鉴于PTEN在细胞活化和增殖中的重要作用,提示HD-11的抗肝纤维化的作用可能是通过PTEN/AKT信号通路实现的。以上内容还未见文献报道,因此本实验重点研究橙皮素衍生物对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化的治疗作用及部分机制。本课题分为以下几个部分:1.HD-11对大鼠肝纤维化的作用Sprague-Dawlay（SD）大鼠（雄性,180-220g）随机分为正常组,模型组,低、中、高剂量组,每组8只。模型组大鼠皮下注射40%CCl4以建立肝纤维化模型,每周2次,共12周;给药组为在造模8周时给予灌胃低、中、高剂量的HD-11,每周2次,共4周;正常对照组则以同样的方法注射等剂量橄榄油。为了确定各组肝组织的损伤和纤维化程度,用HE、Masson染色及免疫组化进行肝组织的病理学组织检查;ALT和AST试剂盒检测肝损伤指标ALT、AST的水平;用Western blot和RT-PCR检测α-SMA,collagen I（col1α1）在肝纤维化大鼠肝组织和原代肝星状细胞中的蛋白和m RNA表达水平。实验结果发现,HD-11对CCl4诱导的大鼠肝纤维化具有一定的治疗作用。2.HD-11对大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）的活化和增殖的影响首先用MTT法检测不同浓度的HD-11（0,1.25,2.5,5,10μM）对HSC-T6细胞的细胞活力的影响,从而判断HD-11对HSC-T6细胞的细胞毒性;再用TGF-β1（10ng/ml）和不同浓度的HD-11（0,1.25,2.5,5,10μM）作用细胞48h,采用MTT法筛选出最小的对细胞无毒性的浓度。采取MTT方法和流式细胞术来检测HD-11对HSC-T6细胞的增殖和凋亡的影响。Western blot和RT-PCR检测HSC-T6细胞α-SMA、col1α1的表达水平。最终的实验结果表明,HD-11能够明显抑制HSC-T6的活化和增殖并将其阻滞在G1期,而对细胞的凋亡没有影响。3.HD-11对PTEN/AKT信号通路的作用在体实验,采用免疫组化检测各组大鼠肝脏组织中PTEN的表达;运用Western blot和RT-PCR分别检测大鼠肝组织和原代肝星状细胞中的PTEN在蛋白和m RNA水平的表达情况。离体实验,同时给予TGF-β1（10ng/ml）和不同浓度的HD-11处理HSC-T6细胞48h,分别应用免疫荧光、Western blot和RT-PCR检测PTEN在HSC-T6细胞上的表达变化。在HSC-T6细胞上分别采用PTEN的特异性抑制剂bpv、PTEN-si RNA和GV141-PTEN对PTEN进行沉默和过表达,此时,运用Western blot和RT-PCR检测PTEN、α-SMA和col1α1在蛋白和m RNA水平的表达变化。结果显示:HD-11能够使PTEN的表达上调;当PTEN被沉默或过表达时,α-SMA和col1α1的表达都上调或下调,而在PTEN被沉默或过表达的基础上再给予HD-11刺激,α-SMA和col1α1的表达均没有发生明显变化。在体实验,应用免疫组化技术检测p-AKT在大鼠肝组织中的表达变化,采用Western blot技术分别检测大鼠肝组织和原代肝星状细胞中p-AKT、cyclin D1和c-myc的表达变化;离体实验,首先,同时给予TGF-β1（10 ng/ml）和不同浓度的HD-11处理HSC-T6细胞48h,Western blot检测p-AKT、cyclin D1和c-myc的表达变化。然后,采用相同方法沉默或过表达PTEN,分别运用Western blot和RT-PCR检测p-AKT、cyclin D1和c-myc的表达变化。结果显示:组织和细胞中的p-AKT的表达被HD-11抑制;当PTEN被沉默或过表达时,p-AKT、cyclin D1和c-myc的表达都上调或下调,而在PTEN被沉默或过表达的基础上再给予HD-11刺激,p-AKT、cyclin D1和c-myc的表达均没有发生明显变化。综上所述,HD-11是通过上调PTEN的表达而抑制其下游PI3K/AKT信号通路的激活进而抑制肝星状细胞的增殖,最终阻断肝纤维化的进程。