缺血性疾病一直是心血管领域研究的热点，严重的威胁着人类的健康。现有的药物治疗仅能部分缓解心肌供血的供需矛盾，并不能从根本上解决心肌缺血的问题，而CABG、PTCA及冠状动脉内支架放置术等机械性心肌再血管化治疗，虽然在大多数患者中产生了良好的疗效，但也存在着远期血管再狭窄等危险。更重要的是，这些再血管化的治疗方法，无法应用于弥漫性冠状动脉远端分支狭窄及CABG术后旁路血管再狭窄的患者，而这类患者的数量十分庞大。人们一直在寻求新的治疗方法。近年来，随着血管生长因子的研究进展为这一问题的解决带来了希望。国内外在大量动物实验的基础上，利用血管生长因子基因治疗技术，在诱导心肌新生血管的形成，提高侧枝循环的代偿能力，实现心肌内源性再血管化方面已取得一定的效果，但这些手段都不能从根本上解决心肌缺血的问题。因为心肌梗死后，仅仅依靠心肌自身新生血管来适应缺血变化的过程非常缓慢，而且一般情况下，也只能部分代偿，难以缓解心功能的损害以及症状的加重。近年来，我们在对患者进行二次心脏手术时发现心包与心脏产生广泛粘连的同时心包动脉网血管增生进入心肌。由此我们考虑是否可利用增生的心包动脉网为缺血心肌提供充分的血液供应。1955年PlachtaA等人做过类似研究，他们首次采用复合硅酸镁（滑石粉）注入心包腔，使心包和心脏在慢性无菌性炎症的刺激下发生粘连（即心包固定术），使心包动脉网增生进入心肌为缺血心肌提供血液供应，虽然可观察到一定量新生血管的产生，但明显增厚的心包与心脏的广泛粘连严重限制了心脏的舒张与收缩功能。因此，我们设想找到一种方法将心包增厚程度控制在一定范围内并与梗死灶周围产生局部粘连，同时给予血管生长素重组腺病毒促进心包动脉网增生进入心肌组织并与心肌内部血管形成广泛的侧支循环网络，达到挽救冬眠心肌和顿抑心肌，阻止进行性的心肌细胞死亡、非梗死区心肌肥大和纤维化，减轻心室重构，预防心功能不全的目的。心包动脉网的动脉来源有胸廓内动脉、胸腺动脉、甲状腺下动脉、甲状颈干、支气管动脉、隔上动脉以及隔下动脉，血供十分丰富。此外，血管生长素（ANG）重组腺病毒制备技术成熟，本实验室也已证明其较强的促血管化作用；以及新的促炎症反应试剂（弗氏不完全佐剂）的应用。这些都为我们实验的可行性奠定了基础。本课题主要研究内容、方法和结果如下：1．高滴度血管生长素(ANG)基因重组腺病毒的制备与鉴定本实验所采用的Ad.ANG是本研究所采用腺病毒DNA末端肽复合物和重组粘粒共同转染293细胞的方法所制备的单克隆ANG重组腺病毒。取本实验室已制备好的单克隆Ad.ANG液解冻后感染293细胞，收集细胞和培养液进行反复冻融离心后得到新一代重组腺病毒液。经用PEG/NaCl沉淀法纯化，得到Ad.ANG滴度为3.2×1010pfu/ml。2．血管生长素（ANG）重组腺病毒的体外转录MOI值为100时进行Ad.ANG在体外转染ECV304, RT-PCR检测表明转染后第1、3、7天，均可测出ANG的mRNA转录，其反应产物电泳后可见长度为184bp的特异性条带，而对照组均未见ANG基因的转录，由此说明ANG重组腺病毒已成功进入ECV304细胞，并可转录出相应的mRNA。Western blot检测结果提示ANG蛋白可高效表达。3．动物模型的建立及分组取75只健康雄性新西兰大白兔75只随机分为5组：第1组：心梗+心包粘连+Ad.ANG组；第2组：心梗+心包粘连+Ad.Null组；第3组：心梗+心包粘连组；第4组：心梗+Ad.Null组；第5组：心梗+Ad.ANG组用枸橼酸芬太尼0.025mg/kg经耳缘静脉注射麻醉家兔后，于回旋支主干第1、2钝缘支之间结扎后ECG检查见II导联ST段弓背状抬高，上抬大于2mm，即认为心梗模型成功建立。5-0聚丙烯线关闭心包腔，用1ml的5EM-BT注射器紧贴心包腔膈面穿刺进入心包腔，注射200μl的弗氏不完全佐剂建立心包粘连模型。病理检查等结果证实此模型稳定、可靠，可达到实验要求。4．心包固定术联合Ad.ANG对缺血心肌的再血管化作用通过RT-PCR检测发现转染ANG重组腺病毒的心肌组织中3天后即可检测出184bp的ANG转录产物，第28天仍有少量表达，而未注射Ad.ANG组结果为阴性，表明本研究中构建的重组腺病毒能够应用心包腔内注射的方法将外源基因转染心肌并在心肌肉表达，其表达时间至少可达4周，这对血管新生所需时间已足够。病理观察显示心肌梗塞发生后各组的毛细血管密度均随时间延长而增加，而第1组增加幅度明显高于其他四个对照组，尤以2周后变化更为突出。4周后第1组心包厚度与2周时相当，但毛细血管密度明显高于2周时；与其他4组相比，毛细血管密度明显增高，统计学差异显著。心脏彩超检查可见心肌梗塞发生后各组的心功能均明显低下，随时间延长均有所改善，至2周后第1组和第5组改善幅度明显高于其他三组，各组4周后心功能的改善幅度均进一步提高，第1、5组的EF值明显高于第2-3组；但第1组与第5组之间EF值无统计学差异，这一结果提示可能是因为心包的增厚及粘连在一定程度上限制了心脏的舒张和收缩。但第1组为缺血心肌提供了较其它4组更为丰富的血液供应，阻止了进行性的心肌细胞死亡。证明了此方法对增加心肌局部血供、拯救顿抑心肌、减轻心室重构和改善心功能的有效性，整体上达到了提高心功能的目的。为治疗缺血性心脏病积累了新的实验资料。综合上述研究结果，我们的结论是：1．本研究应用RT-PCR技术所制备的编码人ANG的cDNA基因片段大，可用来设计引物的区域较少，特异性较差。因此，我们在引物设计、反转录及PCR条件优化方面作了一些有益摸索，为今后类似工作的开展积累了一定的经验。2．本课题中应用的Cosmid-TPC磷酸钙共沉淀转染293细胞的方法，目的基因重组腺病毒获得率高、假阳性率低，同时我们对如何判断重组腺病毒产生，如何获取纯化的高滴度的重组腺病毒建立了一套切实可行的方法，为快速、高效地得到重组腺病毒提供了一条便捷途径。3．本课题在兔心肌梗塞、心包粘连模型中应用Ad.ANG心包腔内注射的方式在心肌组织内发生广泛转染、表达并发挥其生物学效应。证明了ANG基因在机体内可促进缺血心肌内新生血管形成。4．本实验在建立缺血性心肌的心包粘连模型过程中，通过总结前人的经验与自己的探索，找到了一个确实可行的方法。成功建立了动物模型，并证明了其在改善心肌血供和维护心功能方面优于对照组，初步证明了此实验方法对改善心肌血供，阻止进行性的心肌细胞死亡，减轻心室重构，预防心功能不全的发生的有效性。为治疗缺血性心脏病积累了新的实验资料，给缺血性心脏病的治疗提供了新的思路。