随着现代交通运输、体育活动、建筑工程的迅速发展，脊髓损伤spinalcord injury(SCI)的发病率呈逐年升高趋势，其较高的致残率和高昂的医疗费用，给患者的家庭乃至整个社会都带来了沉重的负担。脊髓损伤首先使中枢神经系统内神经细胞遭到破坏，神经轴突断裂，从而导致神经传导束中断，与此同时，中断的神经传导回路又无法自行再生和修复，这使得脊髓发生损伤后常遗留严重而又难以恢复的神经功能障碍。因此，脊髓损伤后神经轴突能否延长并建立有效突触连接是神经功能恢复与否的关键。糖原合成酶激酶3(Glycogen synthase kinase3, GSK3)这一丝氨酸/苏氨酸激酶，做为糖原合成关键酶于20世纪80年代首次被发现。随着研究不断深入，人们发现GSK3广泛表达于人体各组织，以活化状态存在于细胞中，并可以对其下游的各种细胞骨架蛋白、转录因子、跨膜信号分子发挥磷酸化作用。除糖代谢调节功能外，GSK3还在细胞增殖，免疫应答，炎症反应以及肿瘤发生等各类生理病理过程中发挥重要的作用。最近研究表明，GSK3调节作用贯穿整个神经系统，控制着神经系统发育、退变、再生等过程，但其具体的调节效果及作用机制尚未明确。由于GSK3分为GSK3a/b两种单体，而且在神经系统内的表达量极高，这使得以往单纯广泛性药物抑制或SiRNA基因沉默等方法不仅无法彻底改变GSK3的活性和表达量，而且不能精确检测GSK3每种单体的功能。另一方面，损伤后的神经细胞及周围环境内常发生一系列病理生理改变，如神经退行性变、胶质瘢痕增生等，这些复杂环境也是以往的体外细胞培养实验无法模拟的。由此可见，以往的实验方法在对GSK3分子调控神经细胞再生这一复杂过程进行研究时略显不足，而这恰恰也可能是造成实验结论千差万别的原因之一。基于上述背景，我们将研究对象锁定为GSK3转基因小鼠，利用在体电转染的方法建立了总GSK3及各单体基因敲出及过量表达的动物模型。随后通过DRG培养及体内神经卡压等方法，我们检测了总GSK3表达量发生变化对神经轴突再生功能的影响。最后，我们对神经轴突再生中PI3K-GSK3信号转导通路进行研究。通过本研究，我们不仅明确了GSK3在轴突再生过程中所发挥的作用，更阐述了PI3K-GSK3通路调节神经再生的机制。实验研究实验1GSK3a分子对小鼠神经再生过程影响的研究目的：明确GSK3a敲出或过量表达对轴突再生的影响方法：体外实验，取成年GSK3a KO及KI转基因小鼠与WT小鼠分别做实验组对照组，进行体外细胞培养，固定并用Tuj-1染色，计数轴突长度后行统计分析。体内实验，小鼠分组如上，各组小鼠分别行左侧L4/L5DRG内GFP电转染术，2日后行坐骨神经挤压术。固定后取左侧坐骨神经测量轴突再生长度并行统计分析。结果：与WT组对比，无论GSK3a基因敲出组还是过量表达组，轴突长度均无明显差异(P>0.05)。结论： GSK3a敲出或过量表达对小鼠的神经再生功能无影响。实验2GSK3b分子对小鼠神经再生过程影响的研究目的：明确GSK3b敲出或过量表达对轴突再生的影响方法：我们采用GSK3a WT/b flox/flox基因型小鼠，利用体外或体内电转CMV-Cre的方法对GSK3b进行敲出，得到GSK3b KO小鼠。体外实验，取成年GSK3b KO及KI转基因小鼠(KI小鼠及GSK3S9A质粒转染)与WT小鼠分别做实验组对照组，进行体外细胞培养，固定并用Tuj-1染色，计数轴突长度后行统计分析。体内实验，小鼠分组如上，各组小鼠分别行DRG内GFP电转染术，3日后行坐骨神经挤压术。固定后取左侧坐骨神经测量轴突再生长度并行统计分析。结果：GSK3b敲出组轴突再生长度显著优于对照组(P<0.05)，而过量表达组轴突再生长度则显著短于对照组(P<0.05)。结论：GSK3b分子敲出促进轴突再生，过表达抑制轴突再生。实验3GSK3分子总体表达水平对小鼠神经再生过程影响的研究目的：明确GSK3a/b联合敲出或过量表达对轴突再生的影响方法：对GSK3a/b条件性敲出获得GSK3DKO小鼠。体外实验，取成年GSK3DKO及DKI转基因小鼠与WT小鼠分别做实验组对照组，进行体外细胞培养，计数轴突长度后行统计分析。体内实验，小鼠分组如上，各组小鼠分别行DRG内GFP电转染术，3日后行坐骨神经挤压术。固定后取左侧坐骨神经测量轴突再生长度并行统计分析。结果：GSK3DKO组轴突再生长度明显短于对照组(P<0.05),而GSK3DKI组与对照组体轴突长度无差异(P>0.05)。结论：轴突再生过程的完成需要GSK3分子的表达。实验4PI3K-GSK3信号传导通路调控机制的研究目的：明确PI3K与GSK3的上下游关系及GSK3的受控机制方法：体外实验，取GSK3DKI及WT小鼠做实验组与对照组，分别行坐骨神经切断及直接原代培养后，观察轴突长度并行WB对GSK3a/b及底物CRMP2的磷酸化水平进行检测。体内实验，同实验3体内部分。药物干预实验，取成年的GSK3DKI小鼠，分DMSO/LY/BIO/LY+BIO四组并行相应药物处理，培养后观察轴突长度并行WB检测各组GSK3a/b及底物磷酸化水平。结果：GSK3DKI组和WT组轴突再生长度及底物磷酸化水平无明显差异(P>0.05)。结论：轴突再生过程中，PI3K位于GSK3上游，通过不依赖Akt的方式负性调节GSK3。研究结论通过对GSK3分子的神经轴突再生调节作用进行系统的分析，我们了解到，一定表达水平的GSK3是轴突再生的必要条件，而GSK3b分子的缺失则可促进神经轴突的再生。PI3K激酶通过非Akt性的调节方式负性调节GSK3。