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研究背景和目的:视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是视网膜光感受细胞和视网膜色素上皮变性引起的致盲性、遗传性眼病,目前尚无治愈方法。干细胞移植是治疗RP的最具前景的治疗手段。其中胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是一类具有无限扩增和多向分化潜能的干细胞,其中人胚胎干细胞来源的网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)细胞已经成功用于干性老年黄斑变性和Stargart病的Ⅰ/Ⅱ期临床治疗,初步证实其在治疗视网膜色素变性疾病中的安全性和有效性。视网膜祖细胞(retinal progenitor cells,RPCs)是眼早期发育阶段中具备分化为6种视网膜神经细胞、RPE和1种胶质细胞能力的多能性干细胞,它可由ESCs体外诱导分化形成。c-kit是一种干细胞因子受体,已有研究表明,从器官来源的c-kit阳性细胞具有自我更新和多分化潜能。由于c-kit是一种细胞膜抗原,可以通过流式细胞仪分离纯化c-kit阳性细胞。同时,已有研究发现视网膜神经上皮层亦存在c-kit阳性细胞,且其表达高峰集中在视网膜祖细胞的较成熟阶段。本研究将c-kit和ESCs标记物SSEA1(stage-specific embryonic antigen 1,SSEA1)结合,推测在ESCs向视网膜终末细胞分化的过程中c-kit+/SSEA1-细胞群代表发育较成熟的视网膜祖细胞,且细胞成瘤风险很低。从ESCs的分化细胞中筛选出c-kit+/SSEA1-细胞,有进一步将其向RPE细胞分化的能力。RPE细胞层位于视网膜神经上皮和脉络膜毛细血管层之间,它具有特殊的结构和生理机能。在脊椎动物,RPE来源于视杯的神经外胚叶外层,经过一系列诱导作用和时间、空间上的协调,形成成熟的RPE细胞,是体内最早产生黑色素的细胞。在视泡早期,视觉神经上皮的发育主要受多种细胞外转录因子和眼外间叶细胞分泌因子的影响,包括转化生长因子-β超家族(transforming growth factorβfamily,TGF-β)中的骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)和活化素A(activin A)以及成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGFs)等。目前,将ESCs体外诱导分化成RPE细胞的研究已经取得了重要进展,诱导方法主要分为两种:第一,采用PA6间充质细胞系作为饲养细胞层,在无bfgf培养基条件下诱导出rpe细胞并进一步扩增;第二,采用escs悬浮培养形成拟胚体(embryonicbodies,ebs),再将ebs在层黏连蛋白和纤维连接蛋白或者明胶处理过的培养皿上贴壁培养后得到rpe细胞。第1种方法诱导效率低、诱导时间长,本研究采用同第2种方法相似的诱导方法。本课题的研究目的在于初步探索mescs来源的c-kit+/ssea1-视网膜祖细胞体外向rpe细胞分化的方法及效率,为由视网膜色素上皮变性引起的致盲性眼病的细胞移植寻求新的治疗细胞。方法:第一部分:小鼠胚胎干细胞来源的c-kit+/ssea1-细胞的培养及鉴定1.小鼠胚胎干细胞株ab1进行传代培养。干细胞标记物ssea1鉴定传21代、26代和31代的mescs。2.用悬浮培养添加诱导因子形成ebs的方法诱导mescs向视网膜祖细胞分化,免疫荧光染色鉴定分化第9天细胞中c-kit标记物的表达情况。3.用流式细胞分选仪分选出分化第9天细胞中的c-kit+/ssea1-细胞群,免疫荧光染色鉴定分选后细胞中视网膜祖细胞标记物nestin、pax6和c-kit的表达情况。第二部分:小鼠胚胎干细胞来源的c-kit+/ssea1-细胞向视网膜色素上皮细胞的分化及鉴定1.用贴壁培养的方法诱导小鼠胚胎干细胞来源的c-kit+/ssea1-细胞向视网膜色素上皮细胞分化。2.收集分化第0天、第10天和第40天的细胞,流式细胞仪鉴定视网膜色素上皮前体细胞标记物mitf、pax6的表达情况。3.收集分化第0天、第10天和第40天的细胞,免疫荧光染色鉴定分化第40天视网膜色素上皮细胞成熟标记物bestrophin的表达情况,流式细胞仪鉴定视网膜色素上皮细胞成熟标记物bestrophin、cralbp和rpe65的表达情况。结果:第一部分:小鼠胚胎干细胞来源的c-kit+/ssea1-细胞的培养及鉴定1.传21代、26代和31代的mescs均阳性表达干细胞相关标记物ssea1。传代p21的mescs细胞群中ssea1比例为(80.3±4.9)%;p26的mescs细胞群中ssea1阳性细胞比例为(74.9±1.1)%;p31的mescs细胞群中ssea1阳性细胞比例为(72.4±2.3)%。2.在悬浮培养添加诱导因子的培养条件下mESCs在分化第一天形成悬浮的EBs,随着培养天数增加球体体积逐渐增大,于分化第9天检测分化的部分细胞c-kit阳性表达。3.分选出的分化第9天细胞中的c-kit+/SSEA1-细胞群贴壁分化,c-kit+/SSEA1-细胞群阳性表达Nestin、Pax6、Ki67和c-kit。第二部分:小鼠胚胎干细胞来源的c-kit+/SSEA1-细胞向视网膜色素上皮细胞的分化及鉴定1.mESCs来源的c-kit+/SSEA1-细胞向RPE分化第25天观察到―铺路石‖样细胞形态,胞体中可见黑色色素颗粒沉积。2.分化前第0天mESCs细胞中Mitf比例为(1.7±1.5)%,Pax6比例为(6.5±0.2)%;分化第10天,培养体系中Mitf阳性细胞比例为(28.5±7.2)%,Pax6阳性细胞比例为(60.2±15.6)%;分化第40天,培养体系中Mitf阳性细胞比例为(5.7±2.1)%,Pax6阳性细胞比例为(4.6±0.6)%。3.分化前第0天mESCs细胞中Bestrophin阳性细胞比例为(1.2±0.2)%,CRALBP阳性细胞比例为(2.3±0.3)%,RPE65阳性细胞比例为(1.3±0.1)%;分化第10天培养体系中Bestrophin阳性细胞比例为(45.5±1.2)%,CRALBP阳性细胞比例为(6.0±0.1)%,RPE65阳性细胞比例为(4.3±2.2)%;分化第40天培养体系中Bestrophin阳性细胞比例为(61.6±2.4)%,CRALBP阳性细胞比例为(31.0±3.9)%,RPE65阳性细胞比例为(57.8±2.0)%。结论:本课题研究了mESCs向RPCs的分化方法,率先从mESCs来源的RPCs中纯化出c-kit+/SSEA1-细胞,首次发现mESCs来源的c-kit+/SSEA1-视网膜祖细胞具有分化形成RPE细胞的能力。