实验目的 由于各种疾病所致的涎腺分泌功能丧失，在临床上引起严重的口干症状及干燥综合症，给患者带来极大痛苦，严重影响患者的生存质量，至今尚无良好的治疗方法。组织工程学概念提出后，应用颌下腺组织工程的方法，构筑颌下腺组织器官，为治疗涎腺功能丧失所致的口干提供了新的思路和方法。在涎腺组织工程研究中，作为种子细胞附着、增殖、分化提供营养的细胞外基质支架材料，是组织工程研究的重点内容。目前常用的PGA、PLA等支架材料虽然可以起到细胞代谢场所作用，但是由于其本身为人工合成的高分子材料，属于异物，难免会引起机体的免疫排斥或感染。因此，寻找纯天然的生物衍生支架材料的研究受到该领域学者的极大重视。 本研究的目的是利用异体颌下腺组织，经过多步骤的脱细胞处理，获得纯天然的生物衍生支架材料。通过组织学和组织化学研究，分析脱细胞后的生物衍生材料的组织成分；扫描电镜下观察支架材料的结构特点；通过体内、体外的实验研究，分析颌下腺脱细胞生物衍生支架材料的组织相容性和细胞相容性；用培养优化的颌下腺细胞进行复合培养，观察细胞在支架材料上的生长情况；为颌下腺组织工程寻找合适的支架材料。 实验方法 1．应用化学除垢剂及酶消化的方法，对颌下腺组织进行脱细胞处理，制备纯天然的生物衍生支架材料。 2．比较不同浓度TritonX-100对颌下腺组织进行脱细胞作用的影响。 3．应用组织学及组织化学的方法，对制备的颌下腺生物衍生支架材料的基质成分进行分析。通过扫描电镜观察颌下腺脱细胞基质支架材料的组织结构特点，并测量其孔径大小，同时计算其孔隙率。 4.制备领下腺脱细胞基质支架材料的浸提液，通过急性全身毒性试验，分析脱细胞后的生物衍生支架材料对机体的毒性作用。 5.通过体内埋植试验观察领下腺脱细胞基质支架材料对组织的影响，判断该支架材料的组织相容性。 6.MTr比色法检测领下腺细胞与支架材料体外复合培养第7天时的吸光度值(OD值)，测定波长为490nm，检测细胞的存活率，通过计算细胞的相对增殖百分率，判断该支架材料的细胞相容性。 7.应用胰酶消化法进行领下腺细胞的分离、纯化，然后进行领下腺细胞的原代和传代培养，倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态结构。 8.将传代培养的第2代细胞与领下腺脱细胞基质支架材料体外复合培养，第3、5、7天时，通过扫描电镜观察领下腺细胞在支架材料上的生长情况，细胞的表面形态及结构特点。实验结果 一、领下腺脱细胞基质(Submandib己ar Gland Aeellular Ma‘x，SGAM)支架材料的成分分析 1.组织形态学观察:1%TritonX一100脱细胞后，光镜下见细胞轮廓存在，细胞外观形态无明显变化。但细胞核有的固缩，有的碎裂，不规则，细胞核排列无序，呈现拥挤状态;而3%Tritonx一100脱细胞后的支架材料，领下腺细胞成分完全消失，光镜下见不到细胞核形态，粉红色的胶原纤维排列较疏松，可见细胞脱除后遗留的陷窝，呈筛网状结构。 2.透射电镜观察:1%TritonX一100脱细胞后，透射电镜下见细胞膜破损，细胞器破坏、破碎，染色质凝集，形成多个散在的碎块，有的细胞核浓缩，并可见到半月状的凋亡小体。3%TritonX一100脱细胞后，细胞器及细胞核消失，只见残留的细胞轮廓，周边可见不同方向走行的胶原纤维断面。 3.扫描电镜观察:1%TritonX一100脱细胞后，细胞轮廓无明显改变，但其表面细胞膜被破坏，表面不光滑，呈蜂窝状改变。3%TritonX一100脱细胞后，见细胞完全消失，只残留空虚的陷窝，呈大小不等的坑穴状。基质胶原纤维粗细不等，不同层面的胶原纤维走向不一，相互交错呈网状结构。经测定其孔径在巧o一300卿之间，孔隙率为70%士7.25%。 4.免疫组化检测:领下腺脱细胞基质支架材料中，领下腺细胞成分被完全脱除，在保留下来的网状结构的框架中，其主要成分为I、n、111型胶原蛋白及纤维粘连蛋白，这些蛋白成分在脱细胞过程中没有丢失。而作为支架材料的主要成分保留下来，为细胞的附着、增殖、分化和营养代谢提供了良好的环境和场所。 二、领下腺脱细胞基质支架材料的毒理试验 1.急性全身毒性试验:按照生物学评价试验的要求及标准制备SGAM支架材料的浸提液，通过大鼠尾静脉注射24h、48h及72h后，大鼠体重均呈增长趋势，反应正常，未发现中毒反应和死亡，与生理盐水阴性对照组相比较无差别。 2.体内植人试验:植人术后1周，手术创口愈合良好。植入后2周时，在植人的SGAM支架材料周围有成纤维细胞包绕，但未形成纤维囊包裹，植入物易取出;镜下可见有较多中性粒细胞及少量淋巴细胞浸润，分泌胶原纤维。4周时，植人物周围可见一薄层包裹着半透明的纤维膜，镜下可见中性粒细胞开始减少，淋巴细胞无明显增多，纤维膜与周边组织分界清楚。8周时，纤维膜不再继续增厚，且膜密度增大，有变薄趋势，中性粒细胞及淋巴细胞减少，偶可见到吞噬细胞，植人物体积明显变小，有吸收倾向。在空白对照组，镜下?