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传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)可引起鸡的一种急性、高度接触传染性的呼吸道和泌尿生殖道疾病——鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)。自1931年被首次报道后,IB在世界各地均有发生,IBV现已衍生出多种血清型。IBV可与其它病原体混合感染,引起严重的并发症,给养禽业带来巨大损失。IBV抗原性复杂,易发生基因重组和点突变,而且不同血清型间的交叉保护效力低,使IB的防控极具挑战性,因此,开发简便、快速的诊断方法,对IB的防控非常重要。核衣壳蛋白(N蛋白)是IBV的主要结构蛋白,相对较保守,本研究针对N蛋白制备了兔多克隆抗体(PcAb)和鼠单克隆抗体(MAb),建立了检测IBV的双抗体夹心ELISA检测方法,为IBV的诊断提供了一种行之有效的手段。1.针对IBVN蛋白的兔多克隆抗体和鼠单克隆抗体的制备本研究以IBVQXL毒株为基础,对其N蛋白的序列进行抗原性分析,用PCR方法扩增抗原性较强区域对应的N基因片段,然后将产物连至克隆载体上,经基因测序鉴定正确后,再以pET-32a(+)为载体,构建表达N蛋白片段的重组原核表达质粒,转化宿主菌BL21(DE3)后诱导表达并纯化,获得的N蛋白片段用作免疫原,分别免疫成年兔和6-8周龄的BALB/C小鼠。当免疫兔的血清效价达到1:104时,心脏采血制备抗N蛋白的PcAb血清;当免疫鼠的血清效价达到1:104时,取脾脏与SP2/0细胞融合,利用间接ELISA鉴定、筛选杂交瘤细胞,最终获得四株能稳定分泌抗N蛋白MAb的细胞株6F4、7D8、3G2、5C9,制备腹水并鉴定、纯化后,进一步用Western blot鉴定,结果表明获得的单抗可与N蛋白特异结合。2.检测IBV的双抗体夹心ELISA方法的建立本研究以制备的PcAb为包被抗体、MAb为检测抗体,建立检测IBV的双抗体夹心ELISA方法。优化后的反应条件为:包被抗体最佳稀释度为1:64000,检测抗体最佳稀释度为1:4000,封闭液为1%BSA-PBST,酶标抗体稀释度为1:10000,显色底物作用时间为15 min。特异性实验表明,该方法对禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)及禽腺病毒(FAdV)无交叉反应。重复性实验表明,该方法的批内、批间变异系数均小于8%。该方法与检测IBV的PCR方法的阳性符合率为95.9%,阴性符合率为85.2%。总之,本研究制备的抗体可以和IBV的N蛋白特异性反应,以此为基础建立的双抗体夹心ELISA检测IBV方法的特异性好、可重复,且检测结果可靠,为IB防控提供了良好的诊断方法。