骨肉瘤是一种起源于骨间叶细胞的原发性恶性骨肿瘤，约3/4的患者发病年龄在10～30岁，是青少年最常见的骨骼恶性肿瘤，有起病急、肺转移早、死亡率高的特点[1]。在骨肉瘤的治疗中，化疗是不可或缺的重要部分，1970年以前，骨肉瘤的标准治疗方法是截肢术，但5年生存率只有10-20％；自Rosen提出新辅助化疗以来，骨肉瘤治疗效果得到显著的提高，5年生存率达到60-80%，有75%以上的患者可以采取保肢治疗[2]。骨肉瘤临床治疗效果较差，特别是已有远处转移或肿瘤复发的病人，在近50年以来治疗上并未取得很大的进展，远期生存率＜25％[3]。　　临床治疗骨肉瘤的化疗药物仍以阿霉素(ADM)、顺铂(DDP)、和大剂量的甲氨蝶岭(HDMTX)为主，其他还有副作用比较小的异环磷酰胺(IFO)、长春新碱(VCR)等。虽然化疗在骨肉瘤的治疗中具有举足轻重的作用，但骨肉瘤化疗的总体有效率仍徘徊在60％左右。制约其疗效的主要因素有以下两方面，一是高剂量强度所导致的严重的毒副作用，化疗药物大多都存在肾毒性、肝毒性、耳毒性、骨髓毒性、外周神经毒性等毒副作用，二是肿瘤细胞的多药耐药（MDR）问题，也是被认为是化疗失败的主要原因。这些原因严重地限制了这些经典化疗药物在临床上的长期使用和获得更高的临床疗效。因此，寻找或研发一种低毒副作用、无耐药性、疗效肯定的新型抗肿瘤药物和治疗方法显得尤为迫切。近年来，在肿瘤研究领域通过体外实验及动物实验发现，一些生物毒素如蛇毒中的细胞毒素能抑制肿瘤细胞增殖，为临床抗肿瘤治疗提供了新的思路。　　舟山眼镜蛇毒细胞毒素又称心脏毒素或膜毒素，是从眼镜蛇毒中分离出的毒性蛋白，对多种肿瘤细胞有选择性杀伤作用，在蛇毒抗肿瘤研究中占重要地位。目前研究表明它可通过细胞膜作用、线粒体途径或者溶酶体等途径发挥作用。舟山眼镜蛇细胞毒素CTX1是本课题组从舟山眼镜蛇毒中分离纯化的小分子多肽，目前有关CTX1的研究除本课题组报道外未见报道，且有关CTX1抗骨肉瘤作用及机制未见文献报道。本实验拟研究CTX1的抗肿瘤作用及相关作用机制。　　目的：　　通过体外实验探讨舟山眼镜蛇毒细胞毒素CTX1对人骨肉瘤细胞抗肿瘤作用及其机制。　　方法：　　1、MTS法检测CTX1对人骨肉瘤MG-63、U2-OS细胞株相对活力的影响　　2、倒置显微镜下观察经不同浓度CTX1处理后MG-63、U2-OS细胞形态学变化　　3、Hoechst-33258荧光染色观察经不同浓度CTX1处理后细胞核的形态学变化　　4、吖啶橙荧光染色法观察经不同浓度CTX1处理后细胞凋亡形态　　5、流式细胞术检测AnnexinV-FITC/PI双染后MG-63细胞凋亡情况　　6、流式细胞术检测MG-63细胞用不同浓度的CTX1处理后细胞周期变化　　结果：　　1、细胞的活力随着CTX1浓度增大而逐渐减小，生长抑制率随着药物浓度增大而加大，药物浓度越高，细胞的生长抑制作用越趋明显；而且药物作用时间越长，细胞的活力越低，生长抑制率越大，呈现出明显的剂量-时间依赖效应；CTX1对MG-63细胞的12hIC50为20.60μg/ml，24hIC50为12.80μg/ml,36hIC50为7.41μg/ml,48hIC50为4.98μg/ml；CTX1对U2-OS细胞的12hIC50为13.05μg/ml，24hIC50为10.81μg/ml,36hIC50为8.74μg/ml,48hIC50为4.78μg/ml。随着作用时间的增加，IC50值逐渐减小。　　2、倒置显微镜下观察阴性对照组细胞排列规则，连接紧密，大小均匀，细胞形态及胞膜界限清晰，核呈圆形并位于细胞中央；经过不同浓度CTX1处理后，细胞之间连接减少，形态逐渐变得不规则，内部颗粒增多，部分细胞变圆、皱缩，胞膜外突，并出现细胞破裂、脱落死亡，上述改变随着浓度和时间的增加趋向更加明显。　　3、荧光显微镜下对照组人骨肉瘤MG-63细胞胞核完整，着色均匀，荧光弥散而黯淡；不同浓度CTX1处理组细胞，染色质凝聚，细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，着色不规则，呈现细胞凋亡核碎裂等典型变化，而且随药物剂量、时间增加而更趋明显。　　4、在荧光显微镜下观察，对照组MG-63细胞胞核完整，吖啶橙透过正常细胞膜，使细胞核着色均匀，呈均匀黄绿色荧光；经过不同浓度CTX1处理后细胞染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被染成大小不一、致密浓染的绿色颗粒，随着浓度增大，及时间延长，坏死细胞逐渐增多，黄荧光减弱甚至消失。　　5、用CTX1（终浓度为1、2、4、6μg/ml）处理MG-63细胞12h后上机检测，发现晚期凋亡和坏死（右上象限：AnnexinV-FITC+/PI+）细胞较为明显，而早期凋亡（右下象限：AnnexinV-FITC+/PI–）不明显。CTX1能够诱导MG-63细胞凋亡，并呈剂量依赖效应，药物浓度越高，晚期细胞凋亡和坏死越明显。　　6、CTX1能够明显抑制骨肉瘤细胞的增殖，呈S期阻滞，并呈剂量依赖效应：浓度越高细胞S期的比例越高，而G2/M细胞比例则随浓度增高而逐渐减少；G0/G1期变化不明显。　　结论：　　1、CTX1具有体外抗骨肉瘤细胞增殖作用，该作用呈剂量依赖和时间依赖关系，测得CTX1对MG-63细胞的12hIC50为20.60μg/ml，24hIC50为12.80μg/ml,36hIC50为7.41μg/ml,48hIC50为4.98μg/ml；CTX1对U2-OS细胞的12hIC50为13.05μg/ml，24hIC50为10.81μg/ml,36hIC50为8.74μg/ml,48hIC50为4.78μg/ml。　　2、CTX1诱导骨肉瘤MG-63细胞株发生晚期凋亡和坏死，并将细胞周期阻滞在S期。　　3、本研究为蛇毒细胞毒素CTX1在抗骨肉瘤治疗药物的开发及相关后续实验奠定理论基础。