手性氨基酸，特别是用发酵法难以生产的天然、非天然或非蛋白氨基酸在医药、食品、农业及手性药物合成等领域具有广泛的用途，作为主要制备方法之一的L－海因酶系法制备L－氨基酸技术受到人们的普遍关注。本文综述了海因酶法制备光学纯氨基酸的原理及应用，在海因酶多样性及构效关系的基础上，针对海因底物溶解度低、海因酶系相关酶热稳定性较差，较大程度地限制了海因酶法制备光学纯氨基酸技术的应用等问题，重点筛选了耐热海因酶和氨甲酰水解酶产生菌，研究了海因酶产生菌分布特点及最佳候选菌株MH602的发酵条件、产酶条件、酶底物特异性等，克隆了MH602海因酶系基因簇序列，解析了基因簇序列相关基因的结构特征，进一步分析了海因酶和氨甲酰水解酶的进化地位。本文的主要研究成果如下：　　 (1)以DL-5－取代海因为唯一氮源、建立了PDAB显色法与酚红平板显色法相结合的快速检测手段，从土壤样品中筛选到有较好双酶海因酶和氨甲酰水解酶产生菌24株。这些菌株最适生长温度为45－55℃。24株菌转化DL-5－苄基海因的产物氨基酸构型分析表明：其中17株菌生成L－氨基酸，7株生成D－氨基酸，这与文献报道的70％以上菌株是D－海因酶系产生菌不同。推测L－海因酶系产生菌的分布可能与嗜热菌有关。经Biolog菌种鉴定和16S rDNA序列分析鉴定结果表明，海因酶与氨甲酰水解酶产生菌主要分布在Bacillus，Geobacillus，Brevibacillus，Aneurinibacillus，Microbacterium，Kurthia等菌属中，海因酶系产生菌在不同菌属中的分布具有广泛性。　　 (2)利用16S rDNA序列对海因酶产生菌的系统发育分析表明：大多数L-海因酶系产生菌是革兰氏阳性菌，主要属于芽胞杆菌属Bacillus、Aneurinibacillus、Brevibacillu、Kurthia、Geobacillus和非芽胞杆菌属Microbacterium、Arthrobacter等。这组菌耐热性好，最适生长温度45-55℃。而大多数D-海因酶产生菌是革兰氏阴性菌，主要分布于Pseudomonas，Agrobacterium和Burkholderia等菌属中，这类细菌的生长温度在30℃左右。海因酶与氨甲酰水解酶产生菌转化DL-5-取代海因生成氨基酸构型与种属分布、菌株生长温度紧密相关。　　 (3)优化了最佳候选菌Bacillus fordii MH602的发酵与产酶条件，研究了酶的相关性质。最适培养基组分为(g L-1)：甲基海因1.6、蔗糖10、氯化钠3、磷酸二氢钾9、硫酸镁0.25、玉米浆15 mL L-1，pH7.5。诱导剂甲基海因的最适加入时间是菌体发酵到8 h。该菌海因酶是胞内酶，海因酶和氨甲酰水解酶的最适反应温度分别为60℃和45℃，最适pH分别为8.0，7.5。MH602粗酶液转化苄基海因为L-苯丙氨酸的最高摩尔转化率为88.6％。海因酶和氨甲酰水解酶粗酶液分别在50℃和45℃保持6 h后，残留活性几乎无损失，显示了较好的热稳定性。双酶具有较广泛的底物谱，对芳香族海因如苄基海因、苯海因具有较高的选择性，短侧链的脂肪族海因如海因，甲基海因次之，长侧链脂肪族海因选择性较差。通过对转化中间体及产物的构型分析表明：海因酶是非选择性的，而N-氨甲酰水解酶是严格L-选择性的。　　 (4)采用基因组步移法扩增得到MH602 L-海因酶系新基因簇序列，其全长8021 bp。经Blast检索分析基因簇发现5个阅读框，依次为：二氢嘧啶脱氢酶、海因酶、转运蛋白、超蛋白及L-N-氨甲酰水解酶。二氢嘧啶酶与Bacillus sp.NRRLB-14911的二氢嘧啶酶同源性最高为74％；海因酶与Bacillus sp.KNK245海因酶同源性最高为71％；转运蛋白与Bacillus sp.B14905同源性最高为60％；超蛋白与Geobacillus kaustophilus HTA426的超蛋白同源性最高为39％；N－氨甲酰水解酶与Bacillus clausii的L-N－氨甲酰水解酶同源性最高为45％。该耐热性海因酶与氨甲酰水解酶基因均为新基因及相关酶基因均为新基因，海因酶系基因簇序列排列方式与其它报道的海因酶基因簇存在较大差异，虽然具有相同的转录方向，但海因酶和氨甲酰水解酶基因属非连续分布，被转运蛋白基因和超蛋白基因阻隔；且海因酶和L-N－氨甲酰水解酶基因分别有明显的启动子特征区域，而已报道的L－海因酶系基因簇序列往往共用相同的启动子，此发现可指导MH602双酶的高效诱导。将海因酶与氨甲酰水解酶分别在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，进一步验证了该基因的功能。　　 (5)对海因酶同源性及其进化地位进行了分析。不同微生物来源的D-海因酶、L－海因酶和DL-海因酶基因序列比对分析发现存在相同的保守区，如推测的金属离子结合中心PGXXDXHXH及四个保守的天冬氨酸残基和一个赖氨酸残基，这些典型的保守区可能与酶的活性中心有重要关系。各海因酶C－末端同源性均较低。海因酶进化地位分析发现，MH602海因酶与其它金属依赖性的海因酶如二氢嘧啶酶、海因酶、二氢乳氢酸酶、尿囊素酶一样，属于脲酶相关的氨基水解酶超家簇成员之一，这些海因酶催化的底物有相同的结构特征。MH602属于海因酶亚家簇成员，不同构型的海因酶形成一簇，进化地位并无明显差别。　　 (6)分析了L-N－氨甲酰水解酶和β－丙氨酸合成酶同源性及其进化地位。不同微生物来源的L-N－氨甲酰水解酶和β-丙氨酸合成酶序列比对后发现同源性较低，但存在相同的保守序列。MH602的L-N－氨甲酰水解酶与Sinorhizobium meliloti，Pseudomonas sp BS的L-N－氨甲酰水解酶同源性最高，分别为45％和44％，与Saccharomyces Muyveri的β-丙氨酸合成酶同源性为32％。L-N－氨甲酰水解酶与D-N－氨甲酰水解酶的同源性仅为10％左右。对N－氨甲酰或N－乙酰氨基水解酶的氨基酸序列的进化地位分析表明：MH602 N－氨甲酰水解酶是D-N－氨甲酰水解酶、L-N－乙酰氨基水解酶、D-N－乙酰氨基水解酶和β-丙氨酸合成酶形成的超家族成员之一。MH602 N－氨甲酰水解酶属于L-N－氨甲酰水解酶和β-丙氨酸合成酶亚家族成员。该研究将为进一步设计海因酶和L-N－氨甲酰水解酶所催化的新型底物提供参考。