[研究背景]肺癌,也称为支气管肺癌,是最常见的恶性肿瘤之一,也是世界范围内致死率最高的恶性肿瘤。约50%的肺癌患者就诊时已处于进展阶段,预后较差。因此对肺癌发生发展的分子机制的研究一直倍受基础及临床科研人员的关注。大量研究资料表明肺癌的发生发展与遗传或表观遗传的改变相关,最近非编码RNA(nc RNA)包括微小RNA(miRNA)在肺癌发生发展中的作用引起研究人员的关注。miRNA是一类内源性的非编码RNA(长度约19-24个核苷酸),通过在转录后与靶mRNA 3’-非编码区(3’-UTR)的互补核苷酸序列完全或不完全配对来调节基因的表达。目前,在人类中已经鉴定了超过2042个成熟miRNA。这些miRNA构成的网络可以调节超过30%的细胞蛋白的表达。已有的研究表明miRNA涉及广泛的细胞过程,包括细胞增殖,细胞分化,凋亡,形态发育等。约50%的miRNA基因位于癌症中经常扩增或缺失的脆弱位点和基因组区域。因此,miRNA的异常表达在肺癌的发生发展中起重要作用。我们的前期研究发现miR-100-3p在肺癌中低表达,并通过调节Wnt/?-catenin信号通路促进肺癌细胞的恶性进展。同时我们发现在肺癌细胞株中改变miR-100-3p的表达后细胞周期发生明显的变化,这一现象引起我们的关注。细胞周期是细胞重要的生理过程,是细胞增殖和分化的必经过程,而增殖紊乱是细胞癌变的一个重要表现。细胞周期是由众多调节因子及精细的信号通路共同参与调控的复杂过程。CDC25A是细胞周期控制蛋白,它的过表达与许多肿瘤的发生有关,因而引起众多学者的关注。目前已有报道,CDC25A在包括肺癌在内的多种癌细胞系或肿瘤组织中高表达,并且其与肿瘤发生和预后不良有关。最近,有研究发现miRNA如miR-let7,miR-21和miR-449a等可以通过在肿瘤细胞中负向调节CDC25A来抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡。基于此,我们提出疑问miR-100-3p是否可以通过调节细胞周期进而影响肺癌细胞的增殖?这一过程是否有CDC25A的参与?本课题将在前期研究结果的基础上进一步探讨miR-100-3p对肺癌细胞周期的调控作用,并通过确定miR-100-3p直接作用的靶基因,进一步阐明miR-100-3p调控肺癌细胞生长的可能作用机制,从而为肿瘤发生发展的研究提供更多的分子基础和治疗靶点。[研究方法]1.通过流式细胞术(FCM)分别检测抑制或过表达miR-100-3p的肺癌细胞周期的变化情况。(前期实验中,已成功建立稳定表达miR-100-3p inhibitor&negative control的A549细胞株和稳定表达miR-100-3p mimic&negative control的L18细胞株,本课题基于以上细胞进行研究)。2.MTT法、平板克隆和裸鼠成瘤实验检测miR-100-3p对肺癌细胞(A549、L18)增殖能力的影响。3.通过Targetscan和miRanda等生物信息预测软件及双荧光素酶报告基因法验证miR-100-3p与CDC25A的mRNA 3’UTR区具有互补结合作用。4.免疫组化法(IHC)检测CDC25A在肺癌患者的癌组织标本及相应的癌旁组织标本中的表达情况。5.RT-PCR、Western blot检测抑制或过表达miR-100-3p后CDC25A的mRNA和蛋白的表达情况以及CDC25A下游周期相关蛋白cyclin D1,CDK6,p RB,E2F3的表达情况。6.构建CDC25A干扰质粒及过表达质粒,在抑制miR-100-3p的A549细胞中干扰CDC25A的表达并在过表达miR-100-3p的L18细胞中抬高CDC25A的表达,随后检测细胞周期、细胞增殖能力以及CDC25A和其下游周期相关蛋白表达水平的变化。[研究结果]1.miR-100-3p对肺癌细胞周期的影响:流式细胞术检测结果显示,在A549细胞中抑制miR-100-3p的表达后处于G1期的细胞比例较对照组明显减少而S期的比例明显增加,促进了细胞周期由G1期向S期的转化;在L18细胞中过表达miR-100-3p后处于G1期的细胞比例较对照组明显增加而S期比例明显减少,发生G1期阻滞。2.miR-100-3p对肺癌细胞增殖能力的影响:稳定转染miR-100-3p抑制剂的A549细胞增殖能力和克隆形成能力均增加,将其注入裸鼠体内后裸鼠移植瘤的生长速度、重量和体积也显著高于对照组;稳定转染miR-100-3p mimic的L18细胞增殖能力和克隆形成能力均降低,将其注入裸鼠体内后裸鼠移植瘤的生长速度、重量和体积显著低于对照组。3.生物信息学分析显示在CDC25A mRNA 3’UTR区28-32的位置,具有一个含7个碱基的能与miR-100-3p完全互补的种子序列;构建CDC25A@psi-CHECK2-Report-Luc质粒和miR-100-3p mimic/NC,并将其转入293T细胞,与对照组相比荧光强度明显增强,证明了CDC25A是miR-100-3p的靶基因。4.免疫组化结果显示肺癌患者的癌组织标本中CDC25A的表达显著高于相应的癌旁组织。5.抑制或过表达miR-100-3p后,CDC25A及其下游相关周期蛋白cyclin D1CDK6,p RB,E2F3等的表达水平出现相应的升高或降低。6.转染CDC25A干扰质粒或过表达质粒后可以在一定程度上中和因下调或上调miR-100-3p导致的细胞周期、细胞增殖能力以及CDC25A相关的周期蛋白发生的变化。[结论]1.miR-100-3p可以负向调控肺癌细胞的细胞周期,抑制肺癌细胞及肿瘤的生长。2.miR-100-3p通过靶向抑制CDC25A的表达水平影响了肺癌细胞周期G1/S期的转化。