丝状真菌是一类在工业生产,农业加工,医药开发研究中有着重要价值的真核微生物。而里氏木霉则是其中一种主要用来生产纤维素酶的工业菌株。虽然2008年里氏木霉全基因组测序信息被解析,但是受困于丝状真菌分子生物学和遗传工程方法的落后,里氏木霉的研究在深度和广度以及研究的规模上都跟真菌模式菌株酵母有很大的差距。因此为了能够更透彻研究里氏木霉的重要功能基因,高产机理,蛋白分泌机制,生长代谢特质等,我们在后基因组时代更加迫切的需要高效的基因操作手段来深入挖掘里氏木霉的分子机制。对于工业菌株来说,基因组遗传性状的稳定性十分重要。但是细胞中的DNA时常面临到内源和外源的损伤危险。受到损伤的DNA能否精准而迅速的完成修复,对于基因组的完整性和稳定性都有着重要的意义。然而工业宿主里氏木霉关于DNA修复机制领域还有待深入研究。因此本课题主要由以下两部分研究内容组成：第一部分为高效可控的连续基因打靶新工具的构建。1、碳源诱导型筛选标记自切除系统LML2.0：基于Cre/loxP重组酶系统,将Cre表达盒以及筛选标记表达盒共同置于两个同向野生型loxP位点之间,通过碳源诱Cre酶表达一步法完成筛选标记去除的同时也没有Cre的残留。本研究创新性的使用了改造后的cre基因,将内源的基因片段或内含子序列融合进cre的编码序列中,而这样的结构并没有损失重组酶的切除反应效率,通过木糖碳源的诱导,我们获得了80%以上自切除效率。我们还比较了用来表达Cre重组酶的xynl诱导型启动子在不同碳源诱导下的重组效率。这些结果证明LML2.0系统可以在原核和真核中稳定存在,而且在木糖的诱导下可以产生稳定有效的筛选标记回收效果。2、位点突变型筛选标记自切除系统LML2.1：在LML2.0的基础上,将野生型loxP更换成突变型lox位点。分别选择了左臂突变型lox和右臂突变型lox各三种,两两组合成九种结构,其中自切除效率最高的是IoxJT15, loxJTZ17这对组合,能达到91%,其他的组合Cre识别效果都不理想。这说明突变了反向重复序列的lox位点影响了Cre的识别。我们也利用loxJT15和loxJTZ17组合产生的lox32进行了自切除的实验,发现几乎不能被Cre识别。因此我们认为loxJT15和loxJTZ17构建而成的LML2.1a可以高效回收筛选标记的同时不会造成遗留位点产生的基因组不稳定风险。3、以LML2.1a为筛选标记系统的连续基因打靶应用：我们用LML2.1a构建的打靶载体成功敲除了原始菌QM6a中的tku70基因,获得高效的同源重组效率。以QM6aAtku70缺陷株作为受体菌,使用相同的打靶载体对七个里氏木霉内源基因进行两到三轮的敲除。结果证明我们的打靶载体缺失可以高效的进行连续的基因打靶操作,而且每一轮的同源重组率和筛选标记的自切除效率都很稳定。另外我们还发现由于敲除转录因子Xyrl会导致xynl启动子转录受阻,致使Cre表达受到影响。4、光控诱导型筛选标记自切除系统LML3.0：用光作为诱导剂的打靶载体中筛选标记可以达到40-70%左右的切除效率,这就避免了前几代系统中碳源诱导性启动子对碳源的依赖。而且由于光诱导的机制和宿主代谢无关,因此我们的光控系统也摆脱了对宿主的依赖,可以成功应用到其他宿主中去,这一点在其他丝状真菌Neurospora crassa, Aspergillus niger和Metarhizium anisopliae中均有体现。这种光控的筛选标记自切除系统是丝状真菌可以利用的精确控制基因表达新工具。5、非同源末端连接途径(NHEJ)人工可控开关系统OFN1.0：我们利用不同方向的loxP位点构建了可以人工控制tku70基因翻转的表达盒,通过诱导Cre的表达完成基因的开关切换。根据TATA/ox以及loxN位置的不同构建了四种不同翻转效果的表达载体(OFN1.0A-D),通过对翻转不同的表达状态的转录水平分析,得出OFN1.0D关闭状态的严谨程度最好。而且我们从不同表达状态对紫外的敏感程度分析也看出,OFN1.0D可以有效的恢复tku70的表达。因此我们的开关系统的设计可以实现对基因精确可控的干预,在丝状真菌的表达调控上有着一定的应用潜力。第二部分为DNA修复相关基因功能的鉴定。1、发现蓝光可以诱导tku70基因以及其上下游未知基因tre78582和tre108087的转录水平在1-2个小时内提高2-3倍。并且通过分析这三个基因的启动子序列发现含有多个光控转录因子的结合位点。说明这三个基因可能作为一个功能基因簇共同对蓝光响应,受到蓝光的调控。2、通过序列比对以及敲除和回补实验,首次鉴定了tre78582就是里氏木霉亚铁螯合酶基因,我们将该基因命名为hem8。通过敲除实验发现了该基因为敲除致死型,经过了外加血红素更换培养等方法,完成了从异核体到同核体的筛选。通过改变培养基中的碳源说明外加的糖类碳源如葡萄糖和乳糖都容易使菌株的卟啉积累加重而导致敲除菌死亡。另外还利用敲除菌卟啉物质的积累检测其自发红色荧光的方法筛选hem8缺陷株,而由此也可将hem8基因开发成一种血红素营养缺陷型筛选标记,结合自发荧光的检测,这也提供了筛选出转化子的可视化的新方法。3、通过蛋白序列同源比对和系统进化树分析,我们鉴定tre108087编码的是一类新的Zn(Ⅱ2Cys6家族的蛋白,它的相关功能从未报道过。我们通过比较tre108087敲除菌,tku70敲除菌,双敲除菌以及回补菌对各类DNA损伤剂的敏感度变化,得出结论：tre108087基因编码的蛋白是一种DNA修复相关的蛋白,它可能与DNA合成或者拓扑异构酶Ⅰ发生相互作用,而且参与了DSB缺口的修复过程。这些结果也为日后更深入的研究里氏木霉的DNA修复机制奠定了基础。