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柑橘溃疡病(Citrus bacterial canker disease, CBCD)是由地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv. citri (Hasse) Vauterin)引起的一种细菌性病害。在自然条件下,该病菌可以侵染芸香科多种植物,造成柑橘的树势衰退和果实形成溃疡斑,从而降低柑橘果品产量及质量,对我国柑橘出口和产业发展造成严重的经济损失。目前果园中大多使用硫酸铜、氢氧化铜和氯化铜等化学药剂进行防治。为明确含铜杀菌剂的长期使用对该病菌抗药性产生的影响,本研究对柑橘溃疡病菌抗铜相关基因copA和copB进行了克隆和原核表达载体的构建；测定了在室内硫酸铜选择压力下柑橘溃疡病菌抗铜性的变化,具体研究结果如下：1.以提取的柑橘溃疡病菌DNA为模板,对抗铜相关基因copA和copB进行了PCR扩增,获得了大小分别为1798 bp和1111 bp的目标片段,并对扩增产物进行了克隆；构建了这两个基因的原核表达载体(pET-copA和pET-copB),并在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳,结果显示,约69kDa和46kDa的copA和copB特异性重组蛋白得到有效表达。利用原核表达的融合蛋白免疫大耳白兔,制备了copA和copB的多克隆抗体。用间接ELISA法测定了所制备的copA和copB多克隆抗体的效价均为1：6400,确定了该抗体的工作浓度范围为1：2000-1：5000。同时利用制备的抗体对原核表达产物进行了western blot分析,结果显示制备的抗体可与原核表达蛋白发生特异性反应,并且纯化后的抗体非特异性条带较少。2.分析了抗铜相关基因copA和copB的诱导表达对大肠杆菌BL21(DE3)的抗铜性影响,结果显示,将构建的原核表达载体(pET-copA和pET-copB)转入大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达,对大肠杆菌的增殖有明显的抑制作用,但在含不同浓度硫酸铜的培养基中.的增殖无明显差异,表明copA和copB基因的过量表达可使大肠杆菌抗铜性维持在一定的水平。3.以4个柑橘溃疡病菌菌株为出发菌株,其硫酸铜半数致死浓度为100μg/ml,通过在硫酸铜浓度逐步提高的培养基中继代培养近1年,这些菌株对CuSO4浓度抗性明显提高,其致死浓度由原来的150μg/ml提高到270μg/ml-280μg/ml;利用制备的copA和copB的多克隆抗体,对9号菌株的出发菌株和耐铜菌株中copA和copB基因的表达进行western blot分析,结果显示在100μg/ml CuSO4诱导及非CuSO4诱导条件下,抗铜基因copA均可有效表达,且在无CuSO4诱导时出发菌株和耐铜菌株copA的表达量无明显差异,而耐铜菌株在CuSO4诱导下copA的表达量相对增加；但在CuSO4诱导及非诱导条件下均未能检测到抗铜基因copB的表达。