为实现马铃薯全年供应,同时减少采后病虫害、块茎萌发和失水等带来的损失,用于加工的马铃薯通常需要储藏在4℃左右的低温环境中,但这样又带来另一个严重的负面影响—低温糖化(Cold-induced sweetening, CIS),即块茎低温储藏过程中,易发生糖化,出现淀粉含量下降、还原糖积累的现象。发生糖化的块茎在油炸加工过程中,还原糖和游离氨基酸发生Maillard反应,以致出现褐色变化、口感变差,并产生具有神经毒性的致癌物质丙烯酰胺,严重降低了加工产品的品质,给马铃薯种植业带来巨大经济损失。马铃薯品种改良是控制这一危害的重要途径。不同马铃薯基因型发生低温糖化的程度具有差异,特别是一些野生种,具有较强的抗低温糖化的能力。因此,了解马铃薯低温糖化的调节机制和发掘低温糖化的关键基因,对马铃薯加工品质的改良具有重要意义。本研究选用抗低温糖化的野生种Solanum berthaultii (accession CW2-1, ber)和不抗低温糖化的栽培品种(S. tuberosum)鄂马铃薯3号(E3)为材料,筛选块茎低温应答基因,进而通过在不同抗性材料中的基因表达谱分析,获得与低温糖化相关的基因。研究取得的主要结果如下：1.不同抗低温糖化马铃薯的炸片色泽指数和可溶性糖含量对低温的响应为评价储藏温度对不同块茎炸片色泽、还原糖以及蔗糖含量的影响,本研究分别分析了马铃薯ber和E3块茎在4℃和20℃储藏0、3、5、10、15、20、30、45、60、75和90d时相关指标的变化情况。结果表明,在20℃储藏时块茎炸片色泽和糖含量变化较小。总体来说,低温储藏时,块茎还原糖和蔗糖含量随着储藏时间延长而不断增加,尽管在储藏后期有小幅下降,但ber块茎的还原糖含量明显低于E3块茎,蔗糖含量则高于E3块茎,而且还原糖含量和炸片色泽之间呈显著线性正相关。表明野生种ber相对于栽培种E3而言具有较高的抗低温糖化能力。2.反向差减杂交文库的构建为进一步分析ber低温反应及抗低温糖化的机理,本研究在杨建文(2005)构建的ber正向低温差减杂交文库的基础上,分别以4℃和20℃储藏5d的ber块茎为Driver和Tester,构建反向差减杂交文库。在经过两轮差减杂交和选择性PCR扩增之后,将获得的差减杂交产物连入pBlueScript SK(-),通过Amp/X-gal/IPTG筛选获得1920个白色单斑,经过进一步PCR扩增筛选,最终获得由1584个有效克隆构成的反向SSH文库,克隆中的插入片段长度约为500bp。3.ber块茎低温反应基因的确定通过PCR扩增获得ber正向文库中2112条插入序列和反向文库中1584条插入序列,纯化后定量,作为点制芯片的探针。提取ber块茎4℃和20℃储藏5d后的总RNA,逆转录时分别用Cy5和Cy3进行标记,并与cDNA芯片进行杂交,共获得736个差异表达基因,其中663个上调,73个下调。差异表达基因序列分析时共有719个克隆获得良好测序结果。经序列比对、合并重复后,共获得188个代表不同基因的非重复序列片段,其中上调表达序列138个,下调表达序列50个。经分析,149个已知功能的差异表达基因可被归为14种功能类型,主要与细胞自救与防御、代谢、能量、蛋白命运等细胞过程相关。本研究首次对马铃薯低温响应的差异表达基因进行了系统分析,为进一步研究低温糖化机制奠定了基础。4.块茎低温糖化相关基因的筛选以抗低温糖化的ber块茎和易低温糖化的E3块茎为材料,通过qRT-PCR方法全面分析上述188个差异表达基因在4℃和20℃储藏时动态表达变化。结果表明,这些基因中的绝大部分在两种块茎中表现出相同的调节模式,反映了不同基因型块茎低温应答机制具有同一性；但是仍有一些基因的表达模式或转录水平在两种基因型块茎中存在较大差异,初步推测这些“特异表达基因”的表达强弱,决定了不同基因型块茎间低温糖化水平的差异。例如,低温储藏时,ber C20-3-O14(GWD)和C20-6-K02(木糖异构酶)基因的转录被抑制,而E3块茎则为上调表达,并且表达量均高于ber块茎；ber和E3块茎C20-2-D03(BMY7)和C20-4-C15(InvInh)基因具有明显的低温诱导特性,但her BMY7转录水平低于E3,而ber InvInh则高于E3；另外,低温下ber和E3块茎C20-6-F06(GAPDH)和C20-3-A14(丙酮酸激酶)基因都呈先上调后下调的表达模式,但这两个基因在ber块茎中的累积量始终高于E3块茎。因此,与E3块茎相比,ber低温储藏时很可能具有较低的淀粉分解率和较高的糖酵解速率,且ber蔗糖向还原糖转化受到限制。因此,根据本实验结果和已有资料,我们推测导致ber块茎抗低温糖化特征的分子机制,主要与淀粉分解、蔗糖分解和糖酵解三种代谢途径相关。进一步深入研究这些基因的功能,将对马铃薯低温糖化机制提供新的依据,并为马铃薯品质的基因工程改良提供理论指导。