研究背景和目的：肺癌是人类最常见的肿瘤之一,全球每年因肺癌死亡的人数超过100万,其中80～90%的患者为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。近年来,虽然EGFR激酶抑制剂、单克隆抗体药物、新的化疗药物的出现、放疗技术进步和手术术式的改进已使肺癌的治疗取得很大进步,但大多数肺癌患者的预后并没有明显改善,5年生存率仅为10～15%。一方面是由于缺乏早期行之有效的鉴别诊断方法,患者出现临床症状就诊时往往已错过最佳治疗时期。另一方面,就晚期肺癌而言,目前联合化疗有效率仅为20%左右,对难治和复发的患者,真正有效的治疗措施有限。表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)是一种重要的调节细胞生长和存活的生长因子,其通过与细胞膜上的erbB受体家族相结合,诱导受体发生同源或异源二聚体化,进而激活内在的酪氨酸激酶活性以及广泛的下游信号通路,包括Ras-Raf-MAPK通路、PI3K-Akt通路和STAT通路等,从而调控细胞的增殖、分化、生存、血管新生和迁移。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是erbB家族的重要一员,在大多数NSCLC中过表达,是治疗NSCLC的重要靶点。目前,多种针对EGFR的靶向治疗药物,如吉非替尼、厄洛替尼已被批准用于进展期NSCLC的临床治疗。EGF/EGFR信号通路已成为肺癌基础和临床研究的热点和方向之一。因此,对EGF/EGFR信号通路的深入研究,以期发现信号调控的新机制,获得肺癌治疗新的靶点或早期预测指标,以提高NSCLC治疗疗效,具有重要意义。TIP30/CC3,又称HTATIP2(HIV-1Tat interactive protein2),是本研究关注的蛋白。TIP30作为近年来新发现的一种抑癌基因,具有促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管形成和抑制肿瘤转移等多种生物功能。TIP30/CC3的表达失调与肺癌的发生、发展和转移均存在一定的关系。Tong等的研究证实TIP30与NSCLC的转移和低分化明显相关,体外细胞研究提示TIP30过表达能抑制肺癌细胞的增殖。本课题组前期的研究已发现TIP30基因敲除可诱发小鼠自发性肺腺癌,抑制EGF诱导的EGFR降解,延长EGFR下游信号分子激活时间,促进肺癌细胞生长。但是,TIP30与EGF/EGFR信号通路,尤其是EGF/EGFR下游信号通路之间的关系,以及TIP30作为NSCLC诊断和治疗靶点的价值,还值得深入探讨。转录因子是能够结合在基因上游特异核苷酸序列上的蛋白质,活化后从细胞质转位至细胞核,通过识别和结合基因启动子区的顺式作用元件,启动和调控基因表达。转录因子是上游信号传导事件与下游功能基因表达改变的联系纽带,也是信号通路传导研究的核心。传统的受体学说认为,细胞膜受体作为第一信使,在细胞膜上与其配体结合发挥其生物学效应,但细胞膜受体不能进入核内而不能直接影响基因转录。但近年来,许多研究证实了大量的细胞膜受体可以核移位,如：EGFR、 HER-2(human epidermalgrowth factor receptor-2, HER-2)、 FGFR(fibroblast gowth factor, FGFR)、 HER-3等。许多肿瘤如皮肤癌、乳腺癌、宫颈癌、膀肤癌和卵巢癌等的细胞核内高表达EGFR,其作为一种新型的转录因子与其他转录因子相互作用于与细胞周期或增殖密切相关的靶基因,促进肿瘤的发生发展。TIP30亦具有转录因子功能,其通过与其它蛋白形成转录复合体调节基因的开关,参与调节凋亡及增殖相关基因的转录。肿瘤作为一类细胞周期病,其发生与细胞周期调控失常有着密切联系。cyclin D1作为细胞周期调节因子之一,其过度表达是多种人类原发性肿瘤的特征,对肿瘤的诊断和预后判断具有重要意义。cyclin D1的主要功能是促进细胞增殖,其基因转录受多种因素的调节。Lin等发现EGF处理后,肿瘤细胞核内EGFR水平和活化状态明显高于未经处理的细胞,EGFR发生核内化后能结合至cyclin D1启动子区富含AT的保守序列,促进cyclin D1基因的转录,进而促进细胞增殖。因此,核内化的EGFR可以称作是连接外界生长因子信号与细胞周期调控机制的纽带。本课题组前期研究已发现TIP30基因敲除可促进EGF诱导的EGFR细胞核内化,上调cyclin D1表达。近期的研究发现在EGF处理过的的肺腺癌细胞中,细胞核内的TIP30的表达较未经处理组明显增多,并呈时间依赖性。这一发现提示在EGF/EGFR信号通路激活的细胞中,TIP30可能具有核内化的趋势。那么,核内化的TIP30与EGF/EGFR信号通路的关系如何,核内化的TIP30是否和EGFR一样参与cyclin D1基因转录的调节?为了验证该假设,本研究首先通过免疫荧光和免疫印迹技术确定了TIP30核内化这一现象,研究了TIP30核内化的与EGF/EGFR信号通路的相互关系。进一步采用通过免疫共沉淀和染色质免疫共沉淀技术,在转录水平研究了核内化TIP30与细胞周期异常演进的关系及可能的机制。同时,通过对临床病理标本的分析,了解核内化TIP30与EGFR核内化和cyclin D1的关系,为肺癌早期诊断和多靶点治疗提供新的实验依据。方法：1.以肺腺癌A549细胞株为研究对象,分别提取细胞核蛋白和细胞质蛋白,分别以lamin B和prohibition为内参,免疫印迹检测细胞核和细胞质内TIP30表达,判断核浆分离的有效性。2.以EGF/EGFR下游信号通路抑制剂预孵肺腺癌A549和H1299细胞,继予EGF刺激,不同观察终点收集细胞,提取细胞核蛋白,免疫印迹检测不同分组细胞核内TIP30蛋白表达。多聚甲醛固定A549细胞,以荧光标记的抗体定位TIP30,激光共聚焦显微镜检测不同分组细胞TIP30蛋白亚细胞定位情况。3.针对TIP30基因设计并合成四对不同序列的经化学修饰的siRNA,对肺腺癌A549细胞的TIP30基因进行特异性沉默,然后分别检测被不同序列的siRNA干扰后的A549细胞中TIP30蛋白的表达量,从而筛选出抑制效率最高的序列进行后续实验。4.选取干扰效率最高的siRNA转染肺腺癌A549细胞,实验分为空白对照组(未转染的A549细胞)和转染组(转染TIP30siRNA的A549细胞)。分别用real time RT-PCR法和免疫印迹法检测cyclin D1mRNA和蛋白表达的变化,流式细胞仪检测细胞周期的变化。5.根据生物信息学分析结果,参考文献,设计EGFR与CCND1启动子区结合的引物。应用染色质免疫共沉淀的方法,了解转录因子EGFR、TIP30与CCND1启动子区结合的情况；PCR半定量观察TIP30表达干扰后,EGFR与CCND1启动子区结合量的变化情况。6.根据生物信息学分析结果,参考文献,设计HDAC1与CCND1启动子区结合的引物。应用染色质免疫共沉淀的方法,了解转录因子HDAC1与CCND1启动子区结合的情况：PCR半定量观察TIP30表达干扰后,HDAC1与CCND1启动子区结合量的变化情况。免疫共沉淀了解HDAC1与TIP30的相互作用。7.采用免疫组织化学方法检测组织标本中肺腺癌细胞核内TIP30、cyclin D1和EGFR的表达水平,分析核内化TIP30与cyclin D1和核内化EGFR表达的相关性,初步评价核内化TIP30作为肺腺癌治疗或预后指标的价值。8.统计学分析：应用SPSS16.0软件进行统计学处理,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。两组及多组间均数比较采用独立样本t检验和单向方差分析；多重比较时,方差齐性用LSD法,方差不齐用Dunnett法进行统计学分析。临床病理资料等计数资料分析采用χ2检验,Spearman检验进行相关性分析。P<0.05(双侧)有统计学意义。结果：1.EGF可促进肺腺癌A549细胞TIP30核内化EGF刺激后,免疫印迹实验显示肺腺癌A549细胞核内的TIP30蛋白表达增多,细胞质内的TIP30蛋白表达减少,组间比较差异具有显著性(P=0.000)；激光共聚焦显微镜观察显示,EGF处理前TIP30均在细胞浆内表达,EGF处理后6h胞浆大部分TIP30已进入细胞核内,呈颗粒状、散在分布。2.酪氨酸激酶抑制剂可抑制EGF诱导的TIP30核内化EGF分别刺激A549和H1299细胞后,免疫印迹实验显示对照组细胞核内的TIP30蛋白表达逐渐增多,A549细胞不同时间点间差异具有显著性(P=0.000)；吉非替尼加药组细胞核内的TIP30蛋白表达逐渐减少,A549细胞不同时间点间差异具有显著性(P=0.000)。EGF刺激3h和6h后,A549细胞对照组细胞核内TIP30表达均高于吉非替尼组,差异具有显著性(P=0.000)。激光共聚焦实验显示,吉非替尼加药3h和6h组TIP30均表达于细胞浆,细胞核内未见TIP30蛋白表达。3.ERK1/2信号通路抑制剂PD98059可抑制EGF诱导的TIP30核内化EGF分别刺激A549和H1299细胞后,免疫印迹实验显示对照组细胞核内的TIP30蛋白表达逐渐增多,A549细胞不同时间点间差异具有显著性(P=0.002)；PD98059组细胞核内的TIP30蛋白表达逐渐减少,A549细胞不同时间点间差异具有显著性(P=0.000)。EGF刺激3h和6h后,A549细胞对照组细胞核内TIP30表达明显高于PD98059组,差异具有显著性,P值均为0.000。激光共聚焦实验显示,PD98059加药组3h和6h TIP30均表达于细胞浆,细胞核内未见TIP30蛋白表达。4.PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002可抑制EGF诱导的TIP30核内化EGF分别刺激A549和H1299细胞后,免疫印迹实验显示对照组细胞核内的TIP30蛋白表达逐渐增多,A549细胞不同时间点间差异具有显著性(P=0.000)： LY294002组细胞核内的TIP30蛋白表达逐渐减少,A549细胞不同时间点间差异具有显著性(P=0.000)。 EGF刺激3h和6h后,A549细胞对照组细胞核内TIP30表达明显高于LY294002组,差异具有显著性,P值均为0.000。激光共聚焦实验显示,LY294002加药组3h和6h TIP30均表达于细胞浆,细胞核内未见TIP30蛋白表达。5. mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素可抑制EGF诱导的TIP30核内化EGF分别刺激A549和H1299细胞后,免疫印迹实验显示对照组细胞核内的TIP30蛋白表达逐渐增多,A549细胞不同时间点间差异具有显著性(P=0.004)；雷帕霉素组细胞核内的TIP30蛋白表达逐渐减少,A549细胞不同时间点间差异具有显著性P=0.000).EGF刺激3h和6h后,A549细胞对照组细胞核内TIP30表达明显高于雷帕霉素组,差异具有显著性,P值分别为0.014和0.000。6.JAK/STAT信号通路抑制剂AG490不能抑制EGF诱导的TIP30核内化EGF刺激A549细胞,免疫印迹实验显示对照组细胞核内的TIP30蛋白表达逐渐增多,不同时间点间差异具有显著性(P=0.008)；AG490组细胞核内的TIP30蛋白表达亦逐渐增多,不同时间点间差异具有显著性(P=0.043)。 EGF刺激6h后,A549细胞对照组细胞核内TIP30表达与AG490组间差异不具有显著性(P=0.131)。7. TIP30siRNA转染A549细胞后抑制TIP30蛋白的表达免疫印迹实验检测不同siRNA干扰效率,结果表明,干扰组TIP30的表达水平较NC组和MOCK组显著降低(P=0.000),以671号siRNA干扰效率最高,达80%；而NC组和Mock组间的TIP30表达水平无差异(P=0.100)。8.TIP30基因抑制对肺腺癌A549细胞细胞周期的影响通过免疫印迹法和RT-PCR法分别检测未转染和转染TIP30siRNA的A549细胞内cyclin D1mRNA和蛋白的表达水平。转染组cyclin D1蛋白表达较对照组明显增多,差异具有显著性(P=0.001),转染组cyclin D1mRNA表达较对照组明显增多,差异具有显著性(P=0.000)。应用流式细胞仪检测细胞周期,转染组亚S期细胞百分率明显高于空白对照组,差异具有显著性(P=0.004)；G0/G1期细胞百分率则明显低于阴性对照组,差异具有显著性(P=0.003)。9.TIP30调控转录因子EGFR与CCND1启动子区DNA结合能力对照组和TIP30siRNA干扰组A549细胞,以EGFR抗体进行免疫沉淀。EGF刺激Omin, EGFR不能与CCND1启动子区结合。EGF刺激对照组A549细胞30min后,EGFR抗体结合的DNA可以见到清晰的条带,EGF刺激诱导EGFR与CCND1启动子区相结合。EGF刺激30min后,与空白对照组相比,转染TIP3O siRNA组EGFR与CCND1启动子区结合能力增强。10.核内化TIP30不能与EGFR共结合在CCND1启动子区EGF刺激后,免疫共沉淀沉淀TIP30抗体结合的DNA片段,以EGFR与CCND1启动子区结合的DNA序列为引物进行PCR扩增,未见特异性条带。TIP30不能结合在EGFR与CCND1启动子区结合的同一区域。11.TIP30通过通用转录因子HDAC1与CCND1启动子区DNA结合,调控CCND1的转录对照组和TIP3O siRNA干扰组A549细胞,以HDAC1抗体进行免疫沉淀。EGF刺激Oh时,对照组和TIP30干扰细胞组均可以见到清晰的条带,但对照组的条带亮度明显高于TIP30干扰组：EGF刺激3h后,对照组可见微弱的条带,而TIP30干扰组基本无条带。因此,TIP30表达抑制可以减弱HDAC1与CCND1启动子区结合能力。为了进一步了解TIP30与HDAC1之间的相互关系,以HDAC1与CCND1启动子区结合的DNA序列为引物进行PCR扩增,使用TIP30抗体进行免疫共沉淀。EGF刺激后,随着时间延长,TIP30抗体沉淀下来的DNA片段的亮度逐渐增强。因此,EGF可以诱导TIP30结合在HDAC1与CCND1启动子结合的区域,6h结合量达最高峰。12.EGF诱导核内化TIP30与HDAC1形成复合体以EGF刺激A549细胞0h或3h,TIP30可以与细胞核内HDAC1形成转录复合体,3h结合量较0h结合量多。13.肺腺癌患者组织标本中TIP30核内化与EGFR核内化的关系66肺腺癌患者的肿瘤组织切片中,细胞核内TIP30蛋白强表达28例,弱表达38例；相同组织同一位置切片中,细胞核内EGFR蛋白强表达32例,弱表达34例。28例TIP30高表达组中,有33.33%(22/28)患者EGFR呈阴性或弱表达；而在38例TIP30低表达组中,有39.39%(26/38)患者EGFR呈阳性或强表达。在肺腺癌组织中,核内化TIP30与核内化EGFR在蛋白水平的表达呈显著负相关关系(相关系数为-0.465,P=0.000)。14.肺腺癌患者组织标本中EGFR核内化和细胞核内cyclin D1表达的关系30例cyclin D1高表达组中,有33.33%(22/30)患者EGFR呈阳性或强表达；而在36例cyclin D1低表达组中,有39.39%(26/36)患者EGFR呈阴性或弱表达。肺腺癌组织中细胞核内cyclin D1与核内化EGFR在蛋白水平的表达呈显著正相关关系(相关系数为0.454,P=0.000)。15.肺腺癌患者组织标本中TIP30核内化与cyclin D1的关系30例cyclin D1高表达组中,有37.88%(25/30)患者TIP30呈阴性或弱表达；而在36例cyclin D1低表达组中,有38.48%(23/36)患者TIP30呈阳性或强表达。肺腺癌组织中细胞核内cyclin D1与核内化TIP30在蛋白水平的表达呈显著负相关关系(相关系数为-0.476,P=0.000)。结论：1.本研究对目前已知的TIP30功能进行拓展,发现EGF可以诱导TIP30细胞内分布改变,发生核内化。TIP30核内化主要发生在EGF刺激后0-6h,核内化的TIP30进入细胞核内发挥共转录因子的作用。2. EGF/EGFR下游信号通路参与调节TIP30核内化,EGF可能是通过激活ERK和/或PI3K-AKT-mTOR信号通路进而调节TIP30核内化。3.TIP30参与细胞周期异常演进。TIP30基因抑制可诱导cyclin D1蛋白和mRNA表达增加,缩短细胞周期,促进肺腺癌细胞生长。4.TIP30通过间接作用调控转录因子EGFR与CCND1启动子区DNA结合。TIP30基因表达抑制后,EGFR与CCND1启动子区DNA结合能力增加。5.TIP30通过与HDAC1在细胞核内形成转录复合物,抑制EGF诱导的CCND1的转录。6.肺腺癌患者组织标本中,核内化的TIP30与核内化的EGFR、cyclinD1表达具有负相关关系,核内化的TP30对于非小细胞肺癌的临床诊断、治疗和预后判断具有一定价值。