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卵巢癌是女性生殖器官常见肿瘤之一,发病率虽低于宫颈癌和子宫内膜癌居第三位,死亡率却为妇科恶性肿瘤之首。主要原因之一是术后复发。70%患者在术后2年内复发,五年生存率仅为20~30%。肿瘤对化疗药物的敏感性及耐药性是决定术后复发的主要因素,并与患者的预后显著相关。所以明确耐药的原因将为卵巢癌化疗方案的选择提供理论依据,最终提高患者的五年生存率。
在前期研究中发现卵巢癌细胞系RMG-I转染α1,2-岩藻糖转移酶基因后,细胞表面Lewis(y)抗原含量增加,细胞的恶性生物学行为增强,同时对化疗药5-氟脲嘧啶(5-FU)的耐药性明显增强。细胞表面Lewis(y)抗原含量与卵巢癌细胞对铂类耐药性是否有关,国内外尚未见文献报道,而铂类是目前卵巢癌化疗中应用最多的药物。本次实验,以转染α1,2-岩藻糖转移酶基因后的Lewis(y)抗原稳定高表达卵巢癌细胞株RMG-I-H及其对照组RMG-I、RMG-I-C作为体外实验模型,研究细胞表面Lewis(y)抗原含量变化与细胞对卡铂耐药性的关系。
材料与方法:
1、卵巢癌细胞株
RMG-I,RMG-I-C和RMG-I-H由中国医科大学附属盛京医院妇产科教研室林蓓教授提供。RMG-I-H和RMG-I-C分别为上皮性卵巢癌细胞株RMG-I稳定转染表达载体pcDNA3-1(-)-HFUT-H(含α1,2-岩藻糖转移酶基因)及空载体pcDNA3.1得到的细胞株。设RMG-I-H为实验组,RMG-I及RMG-I-C为对照组。
2、四甲基偶氮唑盐(MTT)检测
取指数生长期细胞,常规培养24h。实验组加入工作浓度卡铂,同时设定阴性对照和空白对照。培养72h。于终止前4h,每孔加入20μl MTT(5mg/ml),继续培养。4h后弃上清,每孔加入150μl DMSO,水平震荡10min,于490nm波长处测各孔OD值。取30μg/ml,60μg/ml两个浓度,分别在24h、48h、72h、96h、120h5个时间点重复上述实验。计算各时点IR值。
3、流式细胞仪(FCM)检测
取指数生长期细胞接种于25cm<2>的培养瓶中。实验组加入卡铂使其终浓度分别为30μg/ml,60μg/ml,另设阴性对照组,继续培养72h,收集细胞。按Annexin-V-FICT/PI试剂盒操作说明染色,利用流式细胞仪进行检测。
4、荧光染色法观察观察细胞形态
取指数生长期细胞,接种于6孔板。实验组加入卡铂,使其终浓度分别为30μg/ml,60μg/ml,另设阴性对照组,继续培养72h,染色,荧光倒置显微镜(×400)观察并照相。
结论:
本次实验结果表明Lewis(y)抗原含量增加可能是卵巢癌细胞对卡铂耐药性增强的主要原因。