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牙骨质是一种高度反应性矿化组织，它是牙周膜纤维附着、使牙齿稳定于牙槽窝内、承受和传递合力的重要生理结构。根尖周组织病和牙周疾病一般均有不同程度的牙骨质破坏。根尖周组织病变的修复包括炎症的控制或消除及根尖周骨、牙周膜和牙骨质的重建。牙周组织的再生修复中需要新的结缔组织和牙槽骨的形成，更重要的是需要结缔组织在牙根表面上的再附着，而牙骨质正是结缔组织附着在牙根表面的重要结构。近年来的研究说明牙骨质附着蛋白(cementum attachment protein，CAP)在牙骨质的改建、沉积，形成牙周膜在牙根表面的附丽这一过程中发挥了重要作用。目前对CAP的研究主要集中在其对牙周膜细胞、牙龈成纤维细胞、牙槽骨细胞等的黏附、伸展及有丝分裂活性的影响。本研究探讨提取纯化CAP的简便方法并对所获得的牛CAP进行生物活性鉴定；采用Edman法对所获得的牛CAP进行N末端氨基酸序列测定，根据测得的N末端15个氨基酸序列合成简并引物，运用RT-PCR和简并PCR的方法对牛CAP cDNA信息进行了初步研究，为CAP的重组表达提供一定的理论依据。同时利用所获第四军医人学博_卜学位论文得的蛋白研究了CAP对体外培养人牙囊细胞(human dentalrolliele eells，HoFe)的生物学作用，加深了对eAP的了解。本研究为今后进一步研究CAP结构和功能奠定了一定基础，也为根尖周组织病和牙周疾病的治疗、牙种植体的表面改良、牙齿再植等探索新的方法。本研究分为以下3个部分:一、牛牙骨质附着蛋白的提取纯化与鉴定 拔除2龄牛健康牙齿，清除根面结缔组织，刮下牙骨质，采用醋酸、盐酸肌抽提法获取牛牙骨质基质提取物，经过透析和超滤离心后，行两种提取物的SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳(sodiumdodeeyl sulfate一Polyacrylamide gel eleetrohoresis，SDS一PAGE)，切取盐酸孤提取物经SDS一PAGE后Mr55，000的蛋白质条带，利用异丙醇洗脱蛋白质，并采用三氯醋酸加丙酮沉淀法浓缩蛋白质，冻干后获得牛CAP。经过SDS一PAGE和等电聚焦电泳初步鉴定纯度，均得到单一条带，并发现所获得的牛CAP等电点介于7 .35一8.15。 为了进一步分析所获得的牛CAP，对其进行了肤质量指纹图谱测定及数据库检索，测得CAP分子量为Mr55，261，纯度大于95%，且未发现CAP与任何一种PSI蛋白质数据库中的蛋白质完全匹配。 采用MTT比色法和固相结合分析实验测定了所获得的牛CAp对人牙周膜细胞(human periodontal ligaments eells，HpDLe)勃附性的影响，发现CAP能明显促进HPDLC的附着，CAP的促砧附活性并不是随着其浓度的增加而增加的。在1.0一2.smg/L浓度时促豁附作用为最强，当浓度在2.smg/L时，其促薪附效果最佳，浓度在5.omg/L时，促勤附效果反而有所下降。这些数据与以往学者的研究结果相符，表明所提取纯化的牛CAP具有生物学活性。二、牛牙骨质附着蛋白的N末端氨基酸序列分析与基因克隆的初第四军医人学博士学位论文 步研究。 经过Edman法测定牛CAP的N末端巧个氨基酸残基为:ne (异亮氨酸，I)、pro(脯氨酸，p)、Leu(亮氨酸，L)、Asp(天冬氨酸，D)、Pro(脯氨酸，P)、Val(撷氨酸，V)、Ala(丙氨酸，A)、Gly(甘氨酸，G)、Cys(半肤氨酸，e)、Lys(赖氨酸，K)、Glu(谷氨酸，E)、Pro(脯氨酸，P)、Ala(丙氨酸，A)、Afa(丙氨酸，A)、AsP(天冬氨酸，D)。 利用测得的牛CAP的N末端巧个氨基酸残基序列，设计合成简并引物，提取牛牙骨质总RNA，用Oligo(dt)作引物逆转录合成牛牙骨质cDNA，以牛牙骨质cDNA为模板，利用简并PCR技术进行牛CAP cDNA扩增，PCR产物经1%琼脂搪凝胶电泳得到大小约400bp、SO0bp、600 bp、750 bp、goobp的条带，初步为牛CAP的克隆表达奠定基础。三、牛牙骨质附着蛋白对体外培养人牙囊细胞的生物学作用 为了解该蛋白在牙根发育过程中的作用，采用MTT比色法和固相结合分析实验观察了体外培养人牙囊细胞(h uman dentalfolliele cells，HDFC)在牛CAp包被表面上的附着和伸展情况，发现CAP能明显促进体外培养的HDFC在其包被表面上的附着，最佳促豁附作用的浓度为2.smg/L，但其对HDFC伸展无促进作用。 采用MTT比色法观察了CAP对HDFC增殖的影响，结果发现CAP对体外培养HDFC的增殖无促进作用。酶动力学方法观察了eAP对HnFe碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALp)活性的影响。研究结果表明，CAP在低浓度时不影响HDFC的ALP活性;而在高浓度，可增强其ALP活性。 采用RT一PCR技术首次证明CAP对HDFC内源性骨涎蛋白(bone sialoprotein，Bsp)基因表达的影响具有剂量效应和时间效应。提取不同cAP作用浓度及时间的HDFc总RNA，用oligo(dt)第四军医人学博士学位论文作引物逆转录合成HDFC cDNA，以此为模板，用设计的BSP成熟肤引物进行PCR扩增。将扩增的BSP基因片段从1%琼脂糖凝胶中ha]收，插入pMn 18一T Veetor克隆载体，转化大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆，提取质粒DNA，通过限制性酶切进行鉴定并进行核普酸序列测定。结果表明:克隆到人BSP成熟肤基因片段，序列与GenBank中收录的从人骨细胞cDNA文库中克隆的BSP基