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第一部分PIK3CD-AS1对肾癌细胞侵袭的影响及相关机制研究目的:研究PIK3CD-AS1对肾癌细胞侵袭能力的影响,探索可能存在的机制,为肾透明细胞癌诊断和预后提供参考。方法:我们首先利用实时定量PCR检测构建的稳定高表达PIK3CD-AS1(简称PIK)的PIK细胞是否仍然高表达PIK;然后以PIK细胞作为实验组,PEGFP细胞作为对照组,进行细胞侵袭实验;根据生信分析结果,提取PIK细胞和PEGFP细胞的总蛋白,选择p53为目的蛋白,利用Western blot检测两种细胞表达p53的情况。结果:实时定量PCR检测结果显示PIK细胞相对于PEGFP细胞仍高表达PIK;PIK细胞侵袭能力明显弱于PEGFP细胞;Western blot检测结果显示PIK细胞表达p53蛋白明显高于PEGFP细胞。结论:PIK3CD-AS1抑制肾癌细胞的侵袭迁移,可能的机制是PIK3CD-AS1促进肾癌细胞表达p53蛋白。第二部分DFFA在PIK3CD-AS1抑制肾癌细胞发生发展调控中发挥的作用研究目的:本课题组之前研究成果是PIK细胞较PEGFP细胞表达DFFA降低,深入研究DFFA在PIK细胞增殖、侵袭、凋亡中的作用及探寻相关机制,为未来肾癌靶向治疗提供一定的理论基础。方法:利用质粒转染、药物筛选构建稳定高表达DFFA的769PPIK+DFFA+细胞,利用实时定量PCR验证转染筛选后769PPIK+细胞中的DFFA表达;将稳定高表达DFFA的769PPIK+DFFA+细胞作为实验组,将转染空质粒的769PPIK+DFFA-细胞作为对照组,按照实验方法进行细胞增殖、细胞侵袭、细胞凋亡实验;并提取两株细胞总蛋白,利用Western blot检测两株细胞p53和p AKT(Ser 473)蛋白表达情况。结果:实时定量PCR检测结果显示769PPIK+DFFA+细胞表达DFFA明显高于769PPIK+DFFA-细胞;769PPIK+DFFA+细胞的增殖能力、侵袭能力明显强于769PPIK+DFFA-细胞,769PPIK+DFFA+细胞的凋亡率明显小于769PPIK+DFFA-细胞;Western blot检测结果显示769PPIK+DFFA+细胞表达p53蛋白明显低于769PPIK+DFFA-细胞,且769PPIK+DFFA+细胞表达p AKT蛋白明显高于769PPIK+DFFA-细胞。结论:经转染、药物筛选,成功构建稳定过表达DFFA的769PPIK+DFFA+细胞;DFFA促进769PPIK+细胞的增殖及侵袭迁移能力,并降低其凋亡率,可能的机制是DFFA抑制769PPIK+细胞表达p53蛋白且促进其表达p AKT蛋白。第三部分PIK3CD-AS1周围1M基因表达情况目的:进一步分析PIK3CD-AS1调控肾癌细胞功能的可能机制。方法:为了进一步分析PIK3CD-AS1调控肾癌细胞功能的可能机制,我们查找PIK3CD-AS1 1M范围内基因,并设计上下游引物;以769PPIK+细胞为实验组,769PPIK-细胞为对照组,提取总RNA,利用实时定量PCR检测两组细胞中PIK3CD-AS1周围基因表达量。结果:SLC25A33在769PPIK+细胞中的表达是769PPIK-中的7.6倍(t=10.1,P<0.05);SPSB1在769PPIK+细胞中的表达是769PPIK-中的2.3倍(t=7.7,P<0.05);H6PD在769PPIK+细胞中的表达是769PPIK-中的1.8倍(t=5.1,P<0.05)。余基因未发现明显表达差异。结论:在PIK3CD-AS1周围基因中,发现有SLC25A33、SPSB1、H6PD三个基因随PIK3CD-AS1的高表达而表达增加,其中SLC25A33升高最显著,其可能与PIK3CD-AS1调控肾癌细胞功能有关,可以用于进一步研究。第四部分SLC25A33在PIK3CD-AS1抑制肾癌细胞功能中的作用和机制研究目的:本研究发现PIK3CD-AS1周围1M基因中,SLC25A33在PIK细胞中表达是PEGFP的7.6倍,其可能与PIK3CD-AS1调控肾癌细胞功能有关,进一步研究SLC25A33有可能发现更完善的PIK3CD-AS1调控肾癌细胞功能的机制,并试图研究SLC25A33与DFFA的相互调控关系。方法:利用si RNA-SLC25A33转染769PPIK+细胞,下调769PPIK+细胞表达SLC25A33,并利用实时定量PCR验证转染后769PPIK+细胞中SLC25A33的表达;将下调表达SLC25A33的769PPIK+si RNA-SLC细胞作为实验组,将转染si RNA-ctrl的769PPIK+si RNA-ctrl细胞作为对照组,按照实验方法进行细胞增殖、细胞侵袭、细胞凋亡实验;并提取两组细胞总蛋白,利用Western blot检测两组细胞p53和p AKT蛋白表达情况;利用PCR检测769PPIK+si RNA-SLC细胞和769PPIK+si RNA-ctrl细胞中的DFFA表达情况。结果:实时定量PCR检测结果显示769PPIK+si RNA-SLC细胞表达SLC25A33明显低于769PPIK+si RNA-ctrl细胞;769PPIK+si RNA-SLC细胞的增殖能力、侵袭能力强于769PPIK+si RNA-ctrl细胞,769PPIK+si RNA-SLC细胞的凋亡率小于769PPIK+si RNA-ctrl细胞;Western blot检测结果显示769PPIK+si RNA-SLC细胞表达p53蛋白明显低于769PPIK+si RNA-ctrl细胞,且769PPIK+si RNA-SLC细胞表达p AKT蛋白明显高于769PPIK+si RNA-ctrl细胞;769PPIK+si RNA-SLC细胞表达DFFA明显高于769PPIK+si RNA-ctrl细胞。结论:降低表达SLC25A33促进769PPIK+细胞的增殖及侵袭迁移能力,并降低其凋亡率,可能的机制是降低表达SLC25A33抑制769PPIK+细胞表达p53蛋白且促进其表达p AKT蛋白;DFFA可能是SLC25A33的下游基因。第五部分p53及p AKT与PIK3CD-AS1抑制肾癌发生发展的关系目的:本研究发现PIK3CD-AS1抑制肾癌细胞功能可能和p53和p AKT蛋白有关,且DFFA促进769PPIK+细胞功能亦和p53、p AKT蛋白有关。降低并尽可能排除p53或者p AKT的影响后,通过细胞的增殖、侵袭、凋亡实验,进一步探讨p53及p AKT与PIK3CD-AS1抑制肾癌发生发展的关系。方法:将si RNA-p53转染769PPIK-、769PPIK+、769PPIK+DFFA-、769PPIK+DFFA+细胞,将si RNA-p AKT同样转染上述四种细胞;将转染si RNA-p53的四种细胞行增殖、侵袭、凋亡实验,同样将转染siRNA-pAKT的四种细胞行增殖、侵袭、凋亡实验。结果:转染si RNA-p53前后,769PPIK+细胞增殖、侵袭能力由明显低于769PPIK-细胞变为明显高于769PPIK-细胞,凋亡率由明显高于769PPIK-细胞变为明显低于769PPIK-细胞。769PPIK+DFFA+细胞增殖、侵袭能力由明显强于769PPIK+DFFA-细胞,变为与769PPIK+DFFA-细胞无明显差别,凋亡率由明显低于769PPIK+DFFA-细胞,变为与769PPIK+DFFA-细胞无明显差别。转染si RNA-p AKT前后,769PPIK+细胞增殖、侵袭能力由明显低于769PPIK-细胞,变为明显高于769PPIK-细胞,凋亡率由明显高于769PPIK-细胞,变为明显低于769PPIK-细胞。769PPIK+DFFA+细胞增殖、侵袭能力由明显强于769PPIK+DFFA-细胞,变为增殖能力明显低于769PPIK+DFFA-细胞,侵袭能力与769PPIK+DFFA-细胞无明显差别,凋亡率由明显低于769PPIK+DFFA-细胞,变为与769PPIK+DFFA-细胞无明显差别。结论:p53和p AKT可能是PIK3CD-AS1/DFFA轴调控肾癌细胞功能的下游重要环节。