论文部分内容阅读
本课题组前期的GWAS及目标捕获测序研究发现VPS28基因与奶牛乳脂率和乳脂量显著相关,且其5’UTR区(具体位置用不用写?)有一个C/T突变与乳脂率极强关联(P=7.32E-60)。VPS28基因是内体蛋白分选转运装置ESCRTs的一个亚单位,与ESCRTs的功能和稳定性有关。ESCRTs特异性识别泛素化膜蛋白并将其运输至溶酶体降解,此外它还参与蛋白酶体对胞质中泛素化蛋白质的降解。因此,本研究预测VPS28通过影响ESCRTs或蛋白酶体的功能而影响乳脂的生成,并在细胞水平上分别从DNA、转录组及蛋白质组三种水平上分析该基因突变位点的作用方式及其调控乳脂的机制,试图探索VPS28对乳脂的作用通路。首先,本研究通过对VPS28基因进行启动子活性分析发现其5’UTR的C/T突变可导致基因的表达量下降；然后对该突变进行转录因子结合预测,发现其可导致转录因子由ADR1变为NRF2,两个转录因子的DNA结合域分别是二锌指结构和亮氨酸拉链,且前者与DNA结合的位点数及结合强度均大于后者。因此,本研究认为该突变通过改变转录因子与DNA的结合方式使VPS28基因表达下调。然后,本研究利用RNA干扰技术将BMEC中的VPS28进行干扰,并在转录水平分析其对乳脂的调控机制。通过对比分析相关基因的表达水平,发现VPS28对乳脂的影响可能主要通过影响ESCRTs及蛋白酶体的功能影响了脂肪酸的吸收和从头合成。为进一步验证,本研究又在BMEC中检测了相关蛋白等相关的生化指标的表达水平,发现将VPS28干扰后,泛素化的脂肪酸转运蛋白CD36、脂肪分化相关蛋白ADFP及甘油三酯的表达水平表达水平均上升(P<0.05),蛋白酶体的活性显著下降(P<0.05),并在电子显微镜下观察到干扰VPS28的细胞中存在数量更多体积更大的脂肪滴。该结果表明VPS28受抑制可通过阻碍ESCRTs对泛素化膜蛋白的降解及蛋白酶体对胞质中泛素化蛋白质的降解,以增加脂肪酸吸收和从头合成,最终提高甘油三酯合成增加乳脂生成。最后,本研究又将干扰前后的BMEC进行iTRAQ蛋白质组学分析,以全面揭示VPS28对乳脂合成与分泌的调控机制和作用通路。通过对筛选到的203个差异表达蛋白进行富集分析发现VPS28受到抑制后主要对脂类生成和转运造成影响,然后将这些差异表达蛋白进行通路图的构建,得到了以VPS28为中心且较为清晰的通路图。结合第二部分结果,本研究发现VPS28被抑制后主要通过两种方式调控乳脂生成：1：VPS28低表达阻碍ESCRT功能,蓄积泛素化膜蛋白CD36提高BMEC脂肪酸吸收；2；VPS28低表达降低蛋白酶体活性,蓄积胞质中泛素化蛋白蓄积脂肪酸合成酶FASN及乙酰辅酶A羧化酶ACACA增加脂肪酸的从头合成,最终增加乳脂合成。