背景:自诱导多能干细胞(iPSCs)技术建立以来,人们可以将已经分化的成体细胞重编程成具有与胚胎干细胞类似的多能性细胞。该技术为干细胞与再生医学领域带来了无限的前景。然而,诱导产生多能干细胞的过程错综复杂,其机制尚未完全阐释。在体细胞重编程过程中并不是所有的细胞都能诱导成为多能干细胞,事实上绝大部分的细胞具备与多能干细胞相似的特征形态,但是其核心多能网络并未激活,不表达多能核心基因,称为pre-i PSCs。另外,细胞的增殖分化离不开细胞周期,越来越多的研究表明,不同类型细胞之间的增殖速率与细胞周期存在明显的差异。这些发现提示着诱导多能干细胞与细胞周期有着极其密切的联系,研究细胞周期与诱导多能干细胞或许能揭示重编程机制中不为人知的奥秘。目的:1、通过研究不同类型细胞之间的增殖速率,力求探究其细胞周期内部的联系。2、通过对细胞周期的调控,促使pre-iPSCs重编程成真正的iPSCs。3、构建新型快速的重编程体系,探索快速重编程与细胞周期之间的关系。探索pre-iPSCs如何通过细胞周期诱导成多能干细胞,也许是探究重编程机制的新途径。方法:通过细胞计数分析不同类型多能性细胞的增殖速率;对细胞进行PI染色,结合流式细胞分析技术,分析各细胞系细胞周期内部的分布情况;构建不同体系的RNA-seq,通过数据分析得到细胞周期相关基因的普遍联系;构建过表达和敲降的质粒载体,通过慢病毒包装体系,对细胞进行基因调控;通过RNA提取和qPCR验证相关基因的正确表达;构建新型重编程诱导系统,对比快速重编程与细胞周期之间的联系。结果:本研究首先对比了不同类型细胞的增殖速率,包括OG2 ES、R1 ES、pre-iPSCs等,发现pre-iPSCs的增殖速度最快。然后利用PI染色,结合流式细胞分析技术进一步探究细胞周期,研究数据表明pre-iPSCs经历更长的G1期。为了进一步分析细胞周期如何调控多能性,本研究针对调控G1期的细胞周期基因,对比了多个数据库以及做了相应的qPCR验证,最后设计出了两组针对G1期的调控体系,分别是调控G1期的shCcnd1、shCcnd2、shCdk6和过表达Cdk4,以及调控G1/S检验点的过表达Ccne1、Ccne2、Cdk2。在调控pre-iPSCs相应的细胞周期基因后,培养12天左右产生绿色荧光克隆,qPCR检测Sox2、Nanog、Rex1、Dppa3等多能性基因被成功激活,表明细胞恢复多能性。另外,本研究想探索改变细胞周期的结构会如何影响重编程。于是构建出一种新的重编程体系OvSvK,即在Oct4的C端和Sox2的N端连接转录激活因子VP16,该体系在重编程的第4天所表达的多能性基因达到与OSK重编程第7天相当的水平,OvSvK重编程产生的GFP+克隆数也明显多于OSK重编程,证明OvSvK体系能诱导更加快速的重编程。对其细胞周期分析发现,在重编程过程中G1期所占的比例逐渐缩短。在多种细胞的细胞周期数据中也体现了多能性更高的细胞经历更加短暂的G1期。结论:综上所述,本研究揭示了细胞周期G1期是体细胞重编程的一个障碍,对细胞周期G1期的调控能使pre-iPSCs重新激活多能性,使其向iPSCs转变,提示了细胞周期对重编程的重要性,为研究细胞重编程机制提供新思路。