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目的:泛素化作为一类重要的体内蛋白质翻译后修饰,能够导致靶蛋白的降解。泛素连接酶(E3,Ubiquitin ligase)是泛素化过程中的关键酶之一,负责介导经泛素激活酶(E1,Ubiquitin-activiting enzyme)活化的泛素从泛素结合酶(E2,Ubiquitin-conjugating enzyme)转移至底物蛋白的过程。不同的E3连接酶能够识别不同的底物蛋白,从而决定了泛素化修饰的底物特异性。CUL4A和CUL4B是E3家族的重要成员,它们参与在翻译后水平精确调节细胞周期、DNA修复以及细胞凋亡等过程中关键蛋白的降解及活性,参与多种恶性肿瘤的发生、发展过程。本课题组已在CUL4A和CUL4B的相关功能研究领域做了大量探索。本项目在前期研究的基础上,深入探讨CUL4A和CUL4B在肺癌中的表达及其与临床指标的相关性,并通过体内外实验分析其对肺癌细胞生长及凋亡等过程的调控作用及机制。方法:1.收集天津医科大学肿瘤医院2000年1月-2011年6月期间手术的352例肺癌患者的肿瘤组织标本,以及62例肺癌患者的术后非肿瘤上皮组织标本,进行下列研究:(1)制备组织芯片,并对所有患者的临床病理特征进行详细统计分析。(2)免疫组织化学染色(IHC)方法检测肺癌组织和非肿瘤上皮组织的CUL4A和CUL4B表达情况。(3)提取120例上述肺癌组织的DNA,通过Real-time PCR的方法检测CUL4A和CUL4B的DNA含量。(4)分析CUL4A和CUL4B的表达与患者的临床病理学资料以及预后之间的关系。2.应用慢病毒质粒系统经转染试剂LipofectamineTM2000包装293T细胞,合成具有分别稳定沉默CUL4A、CUL4B基因的慢病毒颗粒,构建稳定沉默CUL4A、CUL4B的肺癌细胞株模型。利用Western Blot、Real-time PCR检测筛选后的细胞其CUL4A、CUL4B蛋白和mRNA的表达情况。3.通过BrdU/7-AAD的方法检测沉默CUL4A、CUL4B蛋白后对肺癌细胞系生长和细胞周期的影响。同时Western Blot检测XPC、p21蛋白水平在转染前后变化情况。通过BrdU/7-AAD流式细胞方法检测在沉默CUL4A的基础上沉默p21后对细胞周期影响的挽救作用。肺癌组织中CUL4A和CUL4B蛋白与XPC、p21蛋白的相关性由IHC方法进行检测。4.利用AnnexinⅤ/7-AAD双染色法,检测敲低CUL4A和CUL4B前后肺癌细胞系凋亡情况的改变。IHC检测肺癌组织中CUL4B与FOXO3a蛋白相关性。利用Western Blot检测FOXO3a、凋亡相关蛋白及相关信号通路蛋白在稳定沉默CUL4A和CUL4B前后之间的变化。siRNA干扰FOXO3a蛋白的表达后观察肺癌细胞系凋亡情况的变化,以确定FOXO3a对肺癌细胞凋亡的调控作用。5.应用肺鳞癌细胞系NCI-H520接种裸鼠评价稳定沉默CUL4A和CUL4B蛋白后对肺癌发生、发展的影响。即通过动物模型验证敲低CUL4A、CUL4B后对细胞生长、凋亡的影响。结果:1.CUL4A和CUL4B在肺癌组织中的表达情况:(1)CUL4A阳性细胞着色定位于细胞核或细胞质中,CUL4B阳性细胞着色只定位于细胞核;肺癌组织中CUL4A和CUL4B的表达水平显著高于62例非肿瘤上皮组织(P<0.001)。(2)CUL4A/CUL4B高表达组中,其DNA含量显著高于低表达组(P<0.001)。(3)CUL4A高表达组患者吸烟人数显著高于CUL4A低表达组。CUL4A和CUL4B表达与患者临床分期、肿瘤体积、远处转移和淋巴结转移,以及总生存(Overall Survival,OS)和无病生存(Disease-free Survival,DFS)显著相关。2.CUL4A在肺癌细胞生长中的作用及机制:稳定沉默肺鳞癌细胞系NCI-H520和小细胞肺癌细胞系NCI-H446的CUL4A后,出现细胞周期S期缩短,G0/G1期阻滞现象,与此同时XPC和p21蛋白表达量升高;在沉默CUL4A的基础上沉默p21后,上述细胞周期变化得到逆转;并且在肺癌组织中CUL4A和XPC及p21的表达呈负相关。提示CUL4A可能通过p21调节肺癌细胞系的细胞周期。3.CUL4B在维持肺癌细胞生长中的作用及机制:(1)在肺癌细胞系中,稳定沉默CUL4B后细胞凋亡显著增加,同时检测到FOXO3a蛋白表达水平升高。用siRNA敲低FOXO3a后细胞凋亡情况得到逆转。结果提示,FOXO3a参与由CUL4B介导的细胞凋亡通路的调控。(2)利用IHC检测到肺癌组织中CUL4B与FOXO3a的表达呈负相关。(3)敲低CUL4B后引起ERK通路活性下降,FOXO3a表达水平上升,磷酸化FOXO3a水平降低,FOXO3a的活性增加。4.通过小鼠模型验证CUL4A/B对肺癌生长的调节作用:在肺癌裸鼠移植瘤模型中,相对于对照组,CUL4A和CUL4B稳定沉默后,明显抑制肿瘤的生长速度。在小鼠移植瘤中通过western blot方法验证CUL4A和XPC、p21的表达呈负相关,CUL4B和FOXO3a的表达呈负相关。结论:1.CUL4A和CUL4B在肺癌组织中表达水平显著升高,DNA含量增多,且与患者不良预后相关。2.在肺癌患者中高表达的CUL4A泛素连接酶,能够通过过度降解DNA修复因子XPC和细胞周期因子p21,造成DNA损伤不能被及时修复,调节细胞周期的改变,从而在肺癌的发生发展中发挥一定的作用。3.在肺癌细胞系中,敲低CUL4B后,ERK通路活性降低,导致磷酸化FOXO3a的含量减少,FOXO3a的活性增加,造成细胞凋亡的增加。4.通过动物实验证实敲低CUL4A、CUL4B后,肿瘤成瘤和生长速度显著降低,从而进一步验证其在肺癌生长中的作用。