论文部分内容阅读
目的:无机砷是一种广泛存在于自然界中的环境毒物。流行病学证据显示,长期无机砷暴露可促发多种心脑血管疾病的发生和发展。无机砷暴露可导致细胞内活性氧水平升高,引起细胞发生氧化应激,进而引发多种疾病的发生和发展。血管内皮细胞是血管的重要组成部分,其氧化损伤在心血管疾病的发生发展中起重要作用,但砷诱发心脑血管疾病的的机制尚不清楚。CNC-bZIP家族的成员转录因子E2相关因子2（Nuclear Factor Erythroid-2 Related Factor 2,Nrf2）是调控抗氧化防御体系的重要上游转录因子。目前Nrf2在砷诱发血管内皮细胞损伤的作用机制尚不清楚,因此本研究旨在探讨无机砷暴露诱发血管内皮细胞损伤的过程中,Nrf2的变化特征和作用,为砷暴露所致心脑血管疾病的机制研究和防治策略提供实验依据。研究方法:1.应用健康成年清洁级雄性野生型C57BL/6小实验动物,建立急性砷暴露模型。2.体内时间-反应关系实验研究将15只小鼠随机分成4组,分别为0（对照,n=3）及2、6、12 h亚砷酸钠染毒组（n=4）。给小鼠腹腔注射5 mg/kg亚砷酸钠溶液。收取小鼠组织前测量小鼠体重。3.体内剂量-效应关系实验:将11只小鼠随机分成3组,分别为对照组（注射PBS溶液,n=3）及1.25 mg/kg亚砷酸钠（n=4）、5 mg/kg亚砷酸钠（n=4）处理组。采用腹腔注射的方式给药染毒6小时。收取小鼠组织前测量小鼠体重。4.采用逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测小鼠主动脉Nrf2信号通路相关基因Nrf2、谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚单位（Gclc）、谷氨酰半胱氨酸连接酶修饰亚单位（Gclm）、醌氧化还原酶1（Nqo1）、金属硫蛋白1（Mt-1）的mRNA水平,血管功能相关基因,如细胞间粘附因子-1（Icam-1）、血管细胞粘附分子-1（Vcam-1）、单核细胞趋化蛋白-1（Mcp-1）、白介素-6（Il-6）、氧化低密度脂蛋白受体-1（Lox-1）、内皮型一氧化氮合成酶（eNos）的m RNA水平。5.采用细胞体外培养方法,分别以不同剂量（0、2、5、10、20、50、100、150μmol/L）NaAsO2处理SVEC4-10细胞24 h,采用MTS（四唑化合物）法检测细胞活性。6.体外时间-效应关系研究分别以5μmol/L NaAsO2处理SVEC4-10细胞0（对照）、2、6、12 h。7.体外剂量-效应关系研究分别以0（对照）、2、5、10μmol/L NaAsO2处理SVEC4-10细胞6 h和12 h。8.采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测SVEC4-10细胞内Nrf2信号通路相关基因,包括Nrf2、Gclc、Gclm、Nqo1和Mt-1的m RNA水平和血管功能相关基因,如Icam-1、Vcam-1、Mcp-1、Il-6、Lox-1和eNos的mRNA水平。9.分别以0、10、20μmol/L NaAsO2处理Scramble对照（SCR）细胞和Nrf2基因稳转沉默（Nrf2-KD）细胞16 h,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:1.体内实验:时间-效应关系实验RT-qPCR结果显示,Nrf2的下游基因（Gclc、Gclm、Nqo1和Mt-1）的mRNA水平呈现先升高后下降的趋势,与对照组比较,5 mg/kg亚砷酸钠染毒小鼠,2 h时Gclc的mRNA表达水平最高,6 h时Gclm、Nqo1和Mt-1的mRNA表达水平最高,差异有统计学意义（P<0.05）。剂量-效应关系实验结果显示,随着染砷剂量增加,Nrf2的下游基因（Gclc、Gclm、Nqo1和Mt1）的mRNA表达水平升高,在染毒剂量为5 mg/kg亚砷酸钠时,与对照组比,差异有统计学意义（P<0.05）。RT-qPCR结果显示,与对照组比较,5 mg/kg亚砷酸钠染毒小鼠,处理小鼠2 h时Icam-1的mRNA表达水平达到峰值,差异有统计学意义（P<0.05）,随着染砷剂量增加其mRNA表达水平升高,而Lox-1和eNOS的mRNA水平升高,在12h时表达水平最高（P<0.05）。2.体外实验:MTS检测结果显示,0（对照）、2、5、10、20、50、100、150μmol/L NaAsO2处理组细胞活性分别为（100.00±19.53）%、（98.18±9.85）%、（96.09±30.04）%、（90.64±8.74）%、（59.75±12.09）%、（35.43±8.58）%、（26.35±5.89）%、（17.54±4.48）%,不同剂量组间细胞活性比较差异有统计学意义（F=18.30,P<0.05）;且20、50、100、150μmol/LNaAsO2处理组细胞活性显著低于对照组（P<0.05）。时间-效应关系实验RT-qPCR结果显示,与对照细胞比较,5μmol/L NaAsO2处理SVEC4-10细胞2、6、12 h后,细胞内Nrf2的下游基因（包括Gclc、Gclm、Nqo1和Mt1）的mRNA表达水平明显升高,6 h达到峰值,差异有统计学意义（P<0.05）;剂量-效应关系实验结果显示,随着染砷剂量增加,Nrf2的下游基因（Gclc、Gclm、Nqo1和Mt1）的m RNA表达水平升高,且差异有统计学意义（P<0.05）。血管功能相关基因Vcam-1、Mcp-1和Lox-1的mRNA表达水平降低,且差异有统计学意义（P<0.05）。细胞凋亡情况Nrf2沉默细胞经NaAsO2处理后,细胞凋亡率比Scramble高。结论:1.体内实验:急性亚砷酸钠处理使主动脉内炎症相关因子的基因表达升高,同时激活小鼠主动脉内的Nrf2信号通路。2.体外实验:NaAsO2暴露引起SVEC4-10细胞损伤,使细胞内炎症相关因子和eNOS的基因表达下降。3.SVEC4-10细胞内Nrf2信号通路活化,激活适应性抗氧化反应;Nrf2的沉默使SVEC4-10细胞对NaAsO2毒性更为敏感。证明血管内皮细胞中Nrf2信号通路的活化在砷诱导的主动脉氧化损伤中发挥重要作用。