肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）是存在于肿瘤细胞中的极小部分细胞，能够驱动肿瘤的持续生长、播散及其后的转移。治疗后残余的CSCs因为耐药而难以被杀死，最终引起肿瘤复发。因此选择性靶向CSCs可为肺癌的诊断和治疗带来巨大的进展。但目前CSCs的分离仍是细胞生物学技术的一个难点，本研究利用CSCs的多重耐药性，以大剂量顺铂短期作用于人肺腺癌A549细胞，在无血清培养基中悬浮成球形培养，体外富集和繁殖LCSCs（lung cancer stem cells,LCSCs），为进一步研究LCSCs的分子生物学功能打下实验基础。同时识别LCSCs的维持和增殖中起作用的分子信号途径，是制定恰当的治疗策略所必需的。Sonic Hedgehog信号通路的激活已经被证实是许多的人类肿瘤及CSCs的维持和增殖中的重要事件，那么SonicHedgehog信号通路在LCSCs中是否也起着重要的作用？具体的机制又如何呢？本文拟对此展开研究。第一部分人肺腺癌A549细胞中的LCSCs的富集、鉴定目的：建立人LCSCs的细胞模型，并对其干细胞特性进行鉴定。方法：选用0、1、2、3、4、5、6、7、8μg/ml顺铂分别作用于人肺腺癌A549细胞，MTT检测细胞增殖抑制率，选用细胞增殖抑制率约70%的顺铂浓度，反复作用A549细胞，获得A549/DDP细胞，继续在无血清培养基（含EGF、bFGF及B27）中悬浮培养，获得富集LCSCs的A549/DDP肿瘤球，鉴定获得的LCSCs的干细胞特性，包括MTT法检测细胞增殖、细胞划痕实验检测细胞迁移能力、RT-PCR检测干细胞基因β-catenin、Bmi-1、Nanog、Oct3/4的表达，PI染色法测细胞周期，流仪细胞仪检测干细胞表面标记物的表达，裸鼠移植瘤实验检测细胞成瘤能力。结果：6μg/ml顺铂作用于A549细胞24h后出现大量A549细胞死亡（约70%），残留的细胞经过反复更换新鲜细胞培养液后继续增殖，约一周左右长至90%，反复上述步骤三次后，获得的A549/DDP细胞在无血清培养基中以悬浮状生长，获得A549/DDP肿瘤球，即LCSCs，与A549细胞、A549肿瘤球相比，具有较高的增殖能力、较强的迁移能力；高表达干细胞基因β-catenin、Bmi-1、Nanog、Oct3/4；细胞周期检测G0/G1期76.8%，S期13.6%，G2/M期10.7%；CD44在A549表达为0.10%，A549肿瘤球（2.68%），在A549/DDP肿瘤球表达量达到92.68%，表达量差异具有统计学意义（p＜0.01）；CD117在A549细胞表达率为0.32%，在A549/DDP肿瘤球表达率为2.96%，表达量经过药物富集后得到显著增加（p＜0.01）；A549/DDP肿瘤球的成瘤能力与20倍数量级的A549细胞的成瘤能力相同，高于2倍数量级的A549细胞、A549肿瘤球、A549/DDP细胞的成瘤能力。结论：1、大剂量顺铂联合无血清培养可以有效富集人肺腺A549细胞中的LCSCs；2、LCSCs具有较强的增殖能力、增加的迁移能力，高表达干细胞相关基因β-catenin、Bmi-1、Nanog、Oct3/4，G0/G1期细胞比例达76.8%，高表达CD44，并伴随着增强的裸鼠体内成瘤能力。第二部分Hedgehog信号通路在LCSCs中的作用目的：探讨Hedgehog信号通路在LCSCs中的作用及其机制。方法：分别用Hh信号通路抑制剂环巴胺（cyclopamine）及激活剂重组SHH蛋白作用于LCSCs，MTT法检测细胞增殖、细胞划痕实验检测细胞迁移、侵袭实验检测细胞侵袭能力、裸鼠移植瘤实验检测细胞成瘤能力的改变，并分别用ELISA法、明胶酶谱法、荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测VEGF、MMP-2、MMP-9的在分泌性水平、活性水平、mRNA及蛋白水平的表达的改变。结果：1、Hedgehog信号通路主要成份SHH、PTCH1、Gli-1、SMO均在LCSCs中高表达；2、抑制LCSCs中的Hedgehog信号通路可以抑制细胞的增殖、降低细胞迁移侵袭能力、减少成瘤能力，而激活LCSCs中的Hedgehog信号通路则可以促进细胞的增殖、降低细胞迁移侵袭能力、减少成瘤能力；3、抑制LCSCs中的Hedgehog信号通路可以减少LCSCs中的VEGF、MMP-2、MMP-9的表达，反之激活LCSCs中的Hedgehog信号通路可以促进VEGF、MMP-2、MMP-9在LCSCs中的表达。结论：Hedgehog信号通路成份SHH、PTCH1、SMO、Gli-1在人LCSCs中高表达；Hedgehog信号通路影响人LCSCs的增殖、迁移、侵袭及成瘤能力；Hedgehog信号通路介导VEGF、MMP-2、MMP-9表达来调节人LCSCs的增殖、迁移、侵袭及成瘤能力。第三部分Hedgehog信号通路主要成份在人肺癌组织中的表达目的：检测Hedgehog信号通路主要成份在人肺癌组织中的表达，并探讨Hedgehog信号通路主要成份与临床病理特征及VEGF、MMP-2、MMP-9表达的相关性。方法：以72例临床行外科手术切除的肺癌病例为研究对象，收集肺癌组织、癌旁组织，并以50例良性肺病变组织为对照组。并收集患者一般临床资料，包括年龄、性别、吸烟史、TNM分期、疾病分期、病理类型、淋巴结转移、远处转移、分化程度及病理类型等。荧光定量PCR法检测肺癌组织、癌旁组织及良性肺病变组织中Hedgehog信号通路主要成份SHH、PTCH1、SMO、Gli-1及VEGF、MMP-2、MMP-9的mRNA表达水平；免疫组织化学法检测组织中SHH、PTCH1、SMO、Gli-1及VEGF、MMP-2、MMP-9的阳性表达；统计学方法分析各因子与临床病理特征的相关性。结果：1、SHH主要表达在肺癌组织的肿瘤细胞中，亚细胞定位在细胞浆，SHH蛋白在肺癌组织中的阳性表达率为73.6%，SHH的表达与淋巴结转移（P=0.000）、远处转移（P=0.024）、TNM分期（P=0.016）相关；PTCH1主要表达于肺癌组织的细胞核中，PTCH1的表达差异与淋巴结转移（P=0.026）、远处转移（P=0.017）及病理组织类型（P=0.001）相关；SMO阳性表达主要在肺癌组织的肿瘤细胞中，亚细胞定位在细胞膜和细胞浆，SMO的蛋白阳性表达率的不同与淋巴转移（p=0.009）、远处转移（p=0.017）及病理组织学类型（p=0.047）相关；Gli-1在肺癌中主要为胞浆染色，Gli-1的阳性表达率与性别（p=0.000）、吸烟史（p=0.006）、年龄（p=0.031）、淋巴结转移（p=0.033）、远处转移（p=0.014）、分化程度（p=0.002）相关，差异具有统计学意义；VEGF主要表达在胞浆中，VEGF的阳性表达与吸烟史（p=0.029）、淋巴转移（p=0.013）、远处转移（p=0.000）、TNM分期（p=0.000）、疾病分期（p=0.021）、分化程度（p=0.000）、病理类型（p=0.023）相关；MMP-2蛋白主要在肿瘤组织的细胞胞浆内表达，MMP-2的阳性表达与淋巴结转移（p=0.005）、远处转移（p=0.035）、TNM分期（p=0.006）、疾病分期（p=0.006）、分化程度（p=0.013）相关；MMP-9蛋白主要在肿瘤组织的细胞胞浆内表达，MMP-9的阳性表达与性别（p=0.010）、吸烟史（p=0.017）、淋巴结转移（p=0.029）、远处转移（p=0.000）、TNM分期（p=0.001）、疾病分期（p=0.000）、分化程度（p=0.002）相关。2、肺癌组织中的SHH、PTCH1、SMO、Gli-1及VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白阳性表达率均高于癌旁组织和良性肺病变组织中的表达，差异有统计学意义，分别为p＜0.05及p＜0.01。3、肺癌组织中SHH、PTCH1、SMO、Gli-1及VEGF、MMP-2、MMP-9的蛋白阳性表达与其对应的mRNA表达均具有正相关性（p＜0.01）。4、免疫组织化学检测人肺腺癌中配体SHH的表达与受体PTCH1（p=0.000）、膜受体SMO（p=0.015）、转录因子Gli-1（p=0.024）的表达显著性相关，受体PTCH1与受体SMO（p=0.002）、转录因子Gli-1（p=0.042）显著性相关，受体SMO与转录因子Gli-1（p=0.034）显著性相关。5、人肺腺癌组织中的VEGF的表达与Gli-1（p=0.011）的表达显著相关，VEGF的表达与SHH（p=0.563）、SMO（p=0.172）、PTCH1（p=0.807）的表达的相关性不显著；而MMP-2在腺癌组织中的表达与SHH（p=0.000）、SMO（p=0.000）、PTCH1（p=0.000）及Gli-1（p=0.006）的表达显著相关；MMP-9在腺癌组织中的表达与SMO（p=0.000）、PTCH1（p=0.006）及Gli-1（p=0.023）的表达显著相关，而与SHH（p=0.508）的表达相关性不显著。结论：1、SHH、PTCH1、SMO、Gli-1、VEGF、MMP-2、MMP-9在人肺癌组织中的表达均与肺癌的淋巴转移和远处转移相关；2、SHH、PTCH1、SMO、Gli-1、VEGF、MMP-2、MMP-9在肺癌组织的表达均高于癌旁和良性肺病变组织，差异具有统计学意义（P＜0.05或p＜0.01）3、在人肺腺癌组织中Hh信号通路主要以配体依赖的方式激活，并且通路主要成份之间相互影响表达4、在人肺腺癌组织中Hh信号通路主要成份的表达与VEGF、MMP-2、MMP-9的表达相关。