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目的:在心血管疾病中,由于心肌缺血再灌注造成的死亡占很大比例。其中,在再灌注过程中,会观察到氧化应激损伤的产生。在缺血/再灌注模型中观察到,当系统无法在氧化剂分子的生产和利用之间建立平衡时,会产生氧化应激。氧化应激过程中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的过量产生导致蛋白质,DNA和脂质损伤,引起细胞损伤。PHLDA1首先在T细胞受体激活诱导的细胞凋亡中被鉴定出来,目前的研究表明PHLDA1在不同的细胞种类和刺激下起到不同的作用,目前关于PHLDA1在氧化应激诱导的心肌细胞（H9c2）损伤和心肌缺血再灌注损伤中的作用尚未报道。本研究主要探究PHLDA1在氧化应激诱导的心肌细胞损伤和心肌缺血再灌注损伤中的作用,以及PHLDA1通过结合Bax在氧化应激诱导的心肌细胞损伤中的作用机制。研究方法:1、培养H9c2心肌细胞,分别用不同浓度的H2O2处理细胞。CCK8实验观察细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡。用Western blot检测PHLDA1蛋白和凋亡相关蛋白caspase 3,PARP1的表达水平。筛选合适药物浓度用于后续试验。300μM H2O2处理H9c2不同时间。Western blot检测PHLDA1蛋白的表达水平。筛选合适药物刺激时间用于后续试验。2、在H9c2细胞中转染Flag-PHLDA1质粒和对照组质粒,转染46h后300μM H2O2处理或者不处理H9c2 90min,CCK8实验观察细胞活力变化,流式细胞术检测细胞凋亡变化,Western blot检测Flag-PHLDA1蛋白和凋亡相关蛋白caspase 3、PARP1的表达水平,JC-1检测试剂盒检测线粒体膜电位的改变,ROS检测试剂盒检测细胞内ROS的改变。3、在H9c2心肌细胞中转染对照siRNA和PHLDA1 siRNA,300μM H2O2处理或者不处理H9c2 90min,CCK8实验观察细胞活力变化,流式细胞术检测细胞凋亡变化,Western blot检测PHLDA1蛋白和凋亡相关蛋白caspase 3、PARP1的表达水平,JC-1检测试剂盒检测线粒体膜电位的改变,ROS检测试剂盒检测细胞内ROS的改变。4、对SD雄性大鼠进行尾静脉注射对照shRNA和PHLDA1 shRNA腺病毒,注射3周后分别进行单纯灌流（对照组）和缺血再灌注（IR）处理,HE染色检测心肌形态变化,TTC检测心肌梗死面积变化,TUNEL染色检测心肌凋亡率变化,Western blot检测PHLDA1和PARP1的表达水平,免疫组化检测caspase 3的表达水平。5、内外源免疫共沉淀实验检测PHLDA1与Bax结合,并在H2O2刺激下结合变化。在H9c2心肌细胞中过表达、敲减PHLDA1后,心肌敲除PHLDA1后,Western blot检测Bax的表达水平。6、Western blot检测PHLDA1影响Bax的表达水平的途径。结果:1、不同浓度H2O2刺激H9c2心肌细胞,随着刺激浓度的增加,细胞活性下降、凋亡率逐渐上升,凋亡相关蛋白和PHLDA1的表达增加。随着刺激时间的延长,PHLDA1的表达增加。2、H9c2心肌细胞中过表达PHLDA1,与转染空载组相比,过表达PHLDA1并给予H2O2刺激后,细胞活性,凋亡率下降,凋亡相关蛋白的表达增加,线粒体膜电位降低更明显,活性氧的产生更多。3、H9c2心肌细胞中敲减PHLDA1,与转染NC组相比,敲减PHLDA1并给予H2O2刺激后,细胞活性,凋亡率上升,凋亡相关蛋白的表达减少,线粒体膜电位降低得到抑制,活性氧的产生减少。4、心肌组织中敲低PHLDA1,与注射NC组相比,敲减PHLDA1并给予缺血再灌注损伤,心肌形态得到维持,心肌梗死面积减少,凋亡蛋白的表达减少,凋亡率减少。5、免疫共沉淀实验验证Bax与PHLDA1结合,并在氧化应激条件下结合增强。6、MG132消除了PHLDA1对Bax蛋白的降解,CHX抑制蛋白质转录,敲低PHLDA1使Bax降解更快。结论:1、氧化应激引起的H9c2心肌细胞损伤和心肌缺血再灌注损伤中,PHLDA1表达增加。2、PHLDA1在氧化应激诱导的H9c2心肌细胞损伤和心肌缺血再灌注损伤中起到促进作用。3、PHLDA1与Bax结合参与氧化应激诱导的H9c2心肌细胞损伤。同时PHLDA1通过蛋白酶体途径引起Bax的变化。