研究背景川崎病（Kawasaki disease，KD）又称皮肤黏膜淋巴结综合征,是一种主要发生于儿童的非特异性全身性血管炎疾病。主要临床特征为发热、双侧球结膜充血、口腔黏膜炎症、颈部淋巴结肿大、皮疹、手足硬肿、红细胞沉降率增快、C反应蛋白增高、血小板增高等,可累及心血管系统,特别是冠状动脉,发生率可达20%～25%，其中5%～10%的冠状动脉病变可发展为缺血性心脏病。目前在一些较发达川崎病已超过风湿热成为儿童后天性心脏病的最常见病因。自1967年首次报道后，本病至今病因未明,发病机制尚不明确。目前多数学者认为KD是一种感染或超抗原触发的超免疫反应，造成内皮细胞和其他细胞损伤,从而形成全身性血管炎。近期研究显示过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（Peroxisome proliferator-activated receptorγ）和脂联素（adiponectin，ADP）具有保护血管内皮和抗炎等作用，并提示可能与冠状动脉损伤的形成与发展有关。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）属于核内受体超家族，有三种亚型：PPARα、PPARβ/δ及PPARγ，近年研究证实，PPARs的三种亚型也可在血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和单核/巨噬细胞等细胞中表达。具有多种生物效应，在脂肪细胞分化、能量代谢、糖代谢、脂代谢、动脉粥样硬化形成、炎性反应及抑制肿瘤细胞等起重要作用。PPARγ其生物学功效主要和炎症，血管内皮细胞与平滑肌纤维细胞增殖、迁移等密切相关。PPARγ配基有天然配基和合成配基2类，天然配基如前列腺素、多不饱和脂肪酸；合成配基如胰岛素增敏剂TZDs类药物，非类固醇类抗炎药如阿司匹林、布洛芬等。激活后的PPARγ受体能抑制巨噬细胞表达炎症因子，如肿瘤坏死因子-α、白介素-6、白介素-1等。在缺血性心脏病初期，PPARγ调控、活化促炎细胞因子释放。PPARγ激动剂可剂量依赖性抑制内皮细胞的增殖，进而抑制内皮细胞的迁移,部分阻断血管内皮生长因子表达细胞粘附分子，阻碍单核细胞和内皮细胞的结合，从而限制血管壁的炎症，保护血管内皮免受损伤。国内有研究发现，缺血性心脏病患者中外周血PPAR-γ表达较正常者明显减低，且降低的水平与缺血的程度呈负相关。近年来有研究发现KD患儿在急性期、恢复期外周血PPARγmRNA高度表达，同时指出PPARγmRNA在KD患儿高度表达对早期动脉粥样硬化的发展具有重要的临床意义。脂联素亦称Acrp30、AdipoQ或GBP28，是由脂肪细胞分泌的一种激素蛋白。脂联素的蛋白质结构由244个氨基酸组成，分为氨基末端的信号肤、中间的胶原样结构域、梭基末端的球形结构域3个部分，具有增强胰岛素敏感性、抗炎、心血管保护作用等多种生物学效应。研究发现，在KD急性期，血清脂联素明显下降，同时发现受损血管内皮细胞处有脂联素聚集。KD急性期合并冠状动脉损伤新生血管内皮都有血管内皮粘附因子-1表达，而脂联素可明显抑制血管内皮粘附因-1的表达和炎性细胞向血管壁迁移过程，产生应激保护作用；另外KD急性期冠状动脉损害时肿瘤坏死因子-α等炎症因子显著增高，而脂联素与补体Clq、肿瘤坏死因子-α有共同的氨基酸序列，其能减少脂多糖刺激后的肿瘤坏死因子-α和白介素-6的释放，抑制TNF-α诱导NF-κB抑制蛋白（Inhibitor of κB，IκB）的降解，阻止NF-κB的激活，发挥其抗炎作用；脂联素还可与不同血管内皮细胞（主动脉内皮细胞和脐静脉等）上脂联素受体1结合，促进一氧化碳释放，对血管产生活性调节作用。用罗格列酮（PPARγ激动剂）喂养动物模型后，脂联素表达及循环中血清脂联素水平可明显升高，提示PPARγ激动剂可能通过直接或间接影响脂联素表达和分泌。研究目的通过检测川崎病患儿PPARγmRNA表达、血清脂联素、血脂、C反应蛋白、血沉、血小板水平，探讨PPARγmRNA和脂联素在川崎病冠脉损伤中的作用。方法1、对象选择2011年10月至2013年7月在我院住院及门诊随访的KD患儿45例，男30例、女15例，男：女=2：l,年龄2个月~6岁,平均(1.9±1.54)岁，其中1岁以下13例(28.9％)，l岁~3岁15例(33.3％)，3岁~以上20例(44.4％)。均符合2002年日本KD研究委员会修订第5版诊断标准，并排除其它疾病；均按《实用儿科学》进行临床分期；所有患儿入院后行心脏超声检查，按《实用儿科学》冠状动脉受累程度分级分期标准，分为冠脉损害组(CAL)18例，均为轻度冠脉扩张，冠脉正常组(NCAL)27例。所有患儿于发病10天内静脉注射丙种球蛋白（IVIG）1-2g/kg治疗，并予阿司匹林口服，剂量30～50mg/kg·d，分三次，热退2周左右减量至3~5mg/kg·d，维持6~8周，如有冠脉病变，用药至冠脉恢复正常后一个月。选取其中32例检测PPARγmRNA表达水平，女11例，男21例，年龄3月～4.6岁，平均年龄（1.75±1.02）岁。选同时间段在我院门诊体检的健康儿童20例为正常对照组，男14例、女6例，男：女=2.3：l，年龄4个月~6岁，平均(1.99±1.34)岁。各组间年龄（F=0.537,P=0.958）、性别（χ2=0.07, P=0.965）无显著性差异。2、标本采集KD组分别于急性期(发热7天内)、治疗后亚急性期（发热8-21天）及恢复期（发热21~30天）清晨空腹采血：①取2ml于干燥管内，离心后收集血清，采用美国美国Beckman公司生产的Unicel DXC8000PRO全自动生化测定仪测定血脂七项：包括三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、载脂蛋白A(APOA)、载脂蛋白B(APOB)、脂蛋白(LPA)，剩余血清分装于-80℃超低温冰箱保存，用于ADPN检测。②取1ml加入EDTA-Na2抗凝管，充分摇匀，美国Beckman公司全自动血液分析仪检测血小板、CRP；取250ul抗凝血加入到750ul的TRIzol中，用于提取RNA。③取2ml加入肝素钠抗凝管，采用魏氏法检测血沉。3、实验方法3.1RT-qPCR检测全血PPARγmRNA的表达采取TRIZOL法提全血中总RNA，以RNA为模板，应用RT试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，然后用ABI7300实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增（实验操作按照说明书进行）。应用ABI7300系统软件分析进行结果分析。3.2双抗体一步夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）法测定ADP浓度。4、统计学处理统计分析采用SPSS13.0软件，所有计量资料数据进行正态性检验，采用X±S表示，组间均数比较用t检验，非正态分布采用Kruskal-Wallis秩和检验；多组间的比较采用单因素方差（analysis of variance,ANOVA）分析，两两比较方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Dunnett’T3检验。相关性分析用Pearson相关分析，非正态分布采用Spearman相关分析；以P<0.05为差异有统计学意义。结果1、32例KD患儿外周血PPAR-γmRNA表达水平急性期(3.29±2.67)、亚急性期(2.60±2.26)、恢复期(2.12±1.90)三期均高于对照组(1.05±0.56)，差异有统计学意义(P＜0.05);KD急性期组PPAR-γmRNA分别和亚急性期组、恢复期比较有明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。KD患儿非冠脉扩张组（NCAL组，22例）外周血PPAR-γmRNA表达水平在急性期(4.58±2.20vs.0.45±0.43)、亚急性期(3.56±2.08vs.0.48±0.47)、恢复期(2.68±2.01vs.0.89±0.75)三期均高于冠脉扩张组（CAL组，10例），差异有统计学意义(P＜0.05)。2、急性期,45例KD组较正常组血清ADP(5.21±2.30μg/ml vs.9.05±2.01μg/ml),TC(3.21±0.77mmol/L vs.4.16±0.25mmol/L)、HDL_C(0.63±0.16mmol/L vs.1.04±0.14mmol/L)、LDL_C(2.02±0.73mmol/L vs.2.61±0.37mmol/L)、APOA(0.84±0.22g/L vs.1.22±0.10g/L) and APOB(0.84±0.22g/L vs.0.96±0.10g/L)均降低，P=0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00；亚急性期,KD组较正常组血清ADP(5.79±2.29μg/ml vs.9.05±2.01μg/ml), HDL_C(0.81±0.17mmol/L vs.1.04±0.14mmol/L)均降低， P=0.00、0.00,KD组较正常组血清TG(1.48±0.78mmol/L vs.1.06±0.14mmol/L)增高， P=0.00；恢复期,KD组较正常组血清ADP(7.73±2.36μg/ml vs.9.05±2.01μg/ml), APOB(0.81±0.19g/L vs.0.96±0.10g/L)均降低， P=0.03、0.00,KD组较正常组血清APOA(1.41±0.26g/L vs.1.22±0.10g/L)增高， P=0.00；3、急性期NCAL组(27例)较CAL组(18例)血清ADP(4.53±1.83μg/ml vs.6.22±2.61μg/ml)降低， P=0.01；亚急性期NCAL组较CAL组血清TG(1.69±0.92mmol/Lvs.1.17±0.32mmol/L)增高，P=0.01；恢复性期NCAL组较CAL组血清ADP(4.53±1.83μg/ml vs.6.22±2.61μg/ml)降低, P=0.03；血清TG(1.05±0.52mmol/L vs.0.70±0.20mmol/L)增高，P=0.00。4、KD患儿外周血PPARγmRNA与PLT、ADP呈明显负相关，r值分别为（-0.45，-0.34），P值分别为（0.00,0.05）；与冠脉损伤呈明显正相关，r=0.80,P=0.00;与年龄、性别、CRP、ESR无相关性。5、KD患儿血清ADPN与CRP呈明显正相关，r=0.40,P=0.03;与冠脉损伤呈明显负相关，r=-0.34,P=0.05;与年龄、性别、PLT、ESR无相关性。结论1、KD患儿在急性期、亚急性期、恢复期外周血中PPAR-γmRNA表达水平明显增高，非冠脉扩张组在急性期、亚急性期、恢复期较冠脉扩张组均有明显增高。2、KD患儿血清ADPN在急性期、亚急性期、恢复期均有显著降低。CAL组血清ADPN水平比NCAL组不同病程比较均有增高，在急性期与恢复期比较有显著增高。3、KD患儿在不同病程中均存在脂类代谢紊乱。KD患儿急性期HDL-C、Apo A、TC、Apo B水平显著下降，在随后的亚急性期HDL-C仍有显著下降，Apo B恢复期仍有下降，其它至恢复期逐渐正常；而TG亚急性期水平显著升高，Apo A恢复期时明显升高; L D L-C及LPA无明显改变。CAL组血清TG水平在亚急性期、恢复期比NCAL组显著降低，而在急性期无显著差异。4、KD患儿外周血PPARγmRNA与血清ADPN、PLT、呈明显负相关，与冠脉损伤呈明显正相关，提示PPARγmRNA表达水平与血清ADPN、PLT、冠脉损伤发生密切相关。KD患儿血清ADPN与CRP呈明显正相关，与冠脉损伤呈明显负相关，提示KD患儿血清ADPN水平与CRP、冠脉损伤发生密切相关。