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目的:肝癌是导致我国城乡居民死亡的主要疾病之一,而肝癌转移是导致肝癌病人死亡的最主要原因,进一步明确肝癌转移的分子机制对肝癌的治疗具有非常重要的指导作用。研究表明可变剪接在肿瘤转移中发挥重要作用,我们前期发现剪接因子PTBP1与肝癌细胞的转移能力相关,且PTBP1高表达与肝癌患者的不良预后有关。初步结果表明PTBP1可能调控AXL的选择性剪接进而影响肝癌的转移进程,但PTBP1调控AXL可变剪接的分子机制,及PTBP1-AXL可变剪接信号轴对肝癌转移的影响仍不明朗。本课题将重点研究PTBP1调控AXL选择性剪接的分子机制,及阐明AXL异构体在肝癌的侵袭与转移生物学进程中存在的功能差异。本研究可为阐明肝癌细胞的转移机制提供新的思路,对抗肝癌转移药物的研发有着重要的意义。方法:1.转录组测序,q PCR及Western-blot检测在高低转移能力肝癌细胞中PTBP1转录及翻译水平的差异。利用TCGA数据库分析肝癌组织与正常肝组织中PTBP1的表达水平差异,以及PTBP1的表达水平对肝癌患者生存率的影响;2.划痕愈合实验及细胞侵袭实验研究过表达或敲降PTBP1对肝癌细胞迁移与侵袭能力的影响;随后Western-blot实验检测过表达及敲降PTBP1对EMT标志物蛋白表达的影响;3.通过RT-PCR及q PCR实验检测肝癌细胞过表达/敲降PTBP1对内源性AXL-L/AXL-S异构体表达水平的影响;体外构建pc DNA3.1-AXL-minigene质粒并转染至上述肝癌细胞中,使用特异性检测外源性AXL-L/AXL-S异构体的引物,通过RT-PCR及q PCR实验检测PTBP1对外源性AXL-L/AXL-S-异构体表达水平的影响;4.通过细胞增殖实验,细胞划痕实验及Transwell实验研究敲降AXL,AXL-L,AXL-S异构体对肝癌细胞增殖,迁移及侵袭能力的影响;通过免疫共沉淀及Western-blot实验研究AXL-L,AXL-S异构体对GAS6配体的结合能力,以及对下游通路蛋白的激活作用。5.利用RBP map与Human Splicing Finder生物信息学网站对PTBP1与AXL pre-m RNA可能存在结合的序列进行预测;根据预测结果,设计检测引物,随后通过CLRIP实验验证PTBP1与AXL pre-m RNA结合的序列区段;体外合成生物素标记的与PTBP1可能存在结合的AXL pre-m RNA片段,随后通过RNA pulldown实验进一步明确PTBP1与AXL pre-m RNA的结合序列;在AXL-minigene水平进行定点突变,随后RT-PCR检测PTBP1是否还能调控AXL Exon10的可变剪接,从而鉴定PTBP1与AXL pre-m RNA的结合位点;6.将p MS2-GFP及pc DNA-AXL-minigene-MS2-12×质粒共转染至肝癌细胞中,随后提取肝癌细胞的核蛋白进行Co-IP实验。再经Western-blot实验检测过表达PTBP1后是否影响U2AF2与AXL minigene的结合;7.细胞侵袭实验,皮下植瘤及动物活体成像实验检测PTBP1与AXL表达水平的变化对肝癌细胞增殖,侵袭及转移的影响。结果:1.相对于低转移的肝癌细胞Hep G2,在高转移的肝癌细胞HCCLM3中PTBP1的转录及翻译水平均显著升高,分别为7.05倍与2.47倍;PTBP1的表达水平与肝癌患者的恶化程度及不良预后呈正相关关系;TCGA数据库显示临床肝癌组织中的PTBP1的表达水平是正常的肝组织的1.65倍;2.过表达PTBP1可促进肝癌细胞的迁移与侵袭,还可增加间质样标志物蛋白Vimentin,N-cadherin等的表达水平,同时降低上皮样标志物蛋白E-cadherin的表达水平,从而促进肝癌细胞的EMT途径;3.在肝癌细胞中AXL为PTBP1的下游靶基因之一,PTBP1可抑制AXL Exon10的可变剪接进程;过表达PTBP1可促进内源性以及外源性AXL-S异构体的生成;4.AXL-L异构体与AXL-S异构体对肝癌细胞增殖,迁移及侵袭的影响不同,敲降AXL-S异构体后可显著抑制肝癌细胞的增殖,迁移与侵袭能力,但敲降AXL-L异构体后则无明显现象(或仅有微弱的抑制作用);5.CLRIP及RNA-pulldown实验结果表明PTBP1可与AXL Exon10上游的第9号内含子中的“tctcctctctgtcctttcttct”及“ctgccctcactccctt”两段多聚嘧啶序列结合。随后AXL-minigene定点突变(如将“tctcctctctgtcctttcttct”突变为“tc Acctc Actgtc Attt Attc A”)实验进一步鉴定了AXL第9号内含子中的“tctcctctctgtcctttcttct”多聚嘧啶序列为PTBP1调控AXL Exon10可变剪接的关键多聚嘧啶序列;6.MS2-GFP-IP系统实验表明PTBP1结合AXL Exon10邻近的“tctcctctctgtcctttcttct”多聚嘧啶序列后,可竞争性抑制U2AF2与该处多聚嘧啶序列的结合,进而促使AXL Exon10的Skipping以生成AXL-S异构体;7.体外细胞侵袭实验,体内皮下植瘤实验及肿瘤转移实验表明PTBP1促进肝癌细胞的侵袭与转移部分依赖于AXL-S的表达水平。结论:1.PTBP1的表达水平与肝癌的恶化程度与不良预后呈正相关关系。PTBP1可通过促进肝癌细胞的EMT途径,进而提高肝癌细胞的迁移及侵袭能力;2.在肝癌细胞中AXL为PTBP1主要的下游靶基因之一;PTBP1可抑制AXL Exon10的可变剪接进程,使得肝癌细胞中AXL-S异构体的表达水平升高;3.AXL长短异构体在肝癌细胞的增殖,侵袭及转移等进程中存在功能上的差异。与AXL-L异构体相比,AXL-S异构体促进肝癌细胞侵袭与转移的能力更强,其与配体GAS6的结合能力更强,且其对下游PI3K-AKT及ERK信号通路的促进作用更为显著;4.PTBP1结合AXL Exon10邻近的多聚嘧啶序列后,可竞争性抑制U2AF2与该处多聚嘧啶序列的结合,进而促使AXL Exon10的Skipping以生成促进AXL-S异构体;5.PTBP1促进肝癌细胞的生长、侵袭及转移进程部分依赖于AXL-S的表达水平。