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研究背景与研究目的:大量研究表明,长链非编码RNAs(long chain non-coding RNAs)在癌症的发生发展过程中有着重要的调控作用。肝癌(Hepatic Carcinoma)是人类癌症中高致死性疾病之一,然而lncRNAs在其的病理进程中的作用及其分子机制的研究却十分有限。异常脂质代谢是癌症的一大标志,肝脏作为中央代谢器官,肝癌的发生总是伴随着脂质代谢的改变。脂肪酸代谢主要受到转录因子SREBP-1c的调控,其靶基因包括ACC和FASN等脂肪酸合成途径中的关键基因。了解lncRNAs在肝癌的脂质代谢中的作用机制是肝癌研究领域的热点之一。我们前期通过大规模芯片检测和数据分析,发现长链非编码RNA SNHG3在HCC中表达显著上升,亦有文献报道lncRNA SNHG3的表达量与HCC的恶性程度和不良预后显著正相关,GO分析表明SNHG3与脂肪酸代谢途径相关。因此,本研究旨在阐明SNHG3在肝癌的脂质代谢中的作用和分子机制,从而为SNHG3作为肝癌诊断的新型标志物和治疗的药物靶点提供理论依据。实验方法:1.利用mRNA-lncRNA混合芯片对16对HCC患者的癌和癌旁组织的转录组水平进行检测,对其数据进行标准化和差异分析,得到表达差异大于2倍的mRNAs含lncRNAs,并按照相对表达丰度,变化倍数以及序列本身的信息等进行进一步筛选;分析数据库TCGA、Oncomine和GEO中候选lncRNA SNHG3在HCC中的表达差异和不同分期之间的差异。另取20对HCC患者的癌和癌旁组织,通过qRT-PCR验证SNHG3在癌和癌旁组织之间的表达差异,并检测SNHG3在人正常肝细胞系LO2和HCC细胞系Hep3B、HepG2、LM3、SMCC7721、MHCC97H的表达差异;2.利用qRT-PCR技术检测SNHG3两个可变剪接体的表达量(2238nt和2346nt),确定在HCC中主要表达的可变剪接体;利用RNAi和qRT-PCR技术,检测SNHG3上下游基因RCC1、PHACTR4和TRNAU1AP以及SNHG3内含子所含的两个核仁小RNAsnoRNA-U17a和U17b的表达变化,确认SNHG3是否存在顺式(cis)调控作用;3.利用RNAi技术,检测HepG2细胞SNHG3基因干扰前后胞内甘油三酯和胆固醇含量的变化;并用qRT-PCR和Western blotting技术检测转录因子SREBP-1c以及靶基因FASN、ACC等的表达变化;构建SNHG3过表达质粒pcDNA3.0-SNHG3,检测HepG2细胞过表达前后胞内甘油三酯和胆固醇含量的变化以及转录因子SREBP-1c以及靶基因FASN、ACC等的表达变化;4.分析SNHG3启动子区域中c-Myc保守位点,并通过对c-Myc进行RNAi和过表达后,检测SNHG3和脂质代谢转录因子SRBP-1c的表达变化;5.预测分析与SNHG3结合的microRNAs,并通过文献查阅这些microRNAs在HCC发生发展过程中的作用以及对脂肪酸代谢的调控作用。实验结果:1.通过对芯片数据标准化和差异分析,得到共得到542个表达的lncRNAs(foldchange>2),并按照相对表达丰度、差异倍数以及序列在染色体中的位置的信息等作了初步筛选,其中SNHG3在HCC中相对表达丰度较大,且表达差异在10倍以上。与芯片结果一致,在数据库TCGA、Oncomine和GEO中SNHG3在HCC组织的表达量均显著高于癌旁组织;qRT-PCR检测发现在20对样本以及HCC细胞系中,SNHG3的表达水平均显著升高。2.SNHG3位于第1号染色体正链(chr1:28832455-28837404),与蛋白编码基因RCC1 5’端3个外显子重叠,含有polyA尾及两个可变剪接体。在不同HCC细胞系和肝癌组织中比较两者的表达量,发现长度较短(2238nt)的可变剪接体为主要存在形式,较长的可变剪接体(2346nt)表达量有时检测不到,因此我们主要对长度较短(2238nt)的可变剪接体进行检测和后续的实验;利用RNAi技术对SNHG3进行敲减后,其上下游基因RCC1、PHACTR4和TRNAU1AP以及SNHG3内含子所含的两个snoRNA-U17a和U17b的表达没有发生显著变化。3.对芯片数据中与SNHG3表达相关的基因进行GO分析发现,SNHG3主要参与HCC细胞周期(cell cycle)、细胞迁移(cell migration)以及脂肪酸代谢(Fatty acid metabolic);芯片数据分析表明SNHG3和脂肪酸代谢关键基因SREBP-1c的mRNA表达量显著正相关;RNA干扰SNHG3后HepG2细胞中胞内总甘油三脂(Triglyceride,TG)和胆固醇的含量明显下降;SREBP-1c及其靶基因FASN和ACC的表达也明显下降;过表达SNHG3后HepG2细胞中胞内总甘油三脂(Triglyceride,TG)和胆固醇的含量显著上升,SREBP-1c、FASN和ACC的表达水平显著升高,并随着SNHG3过表达质粒浓度的升高而显著上升。4.通过软件预测发现SNHG3启动子区域存在多个c-Myc结合保守位点,RNAi或者抑制剂10058-F4抑制c-Myc的表达后,SNHG3的表达量明显下降;反之,过表达c-Myc后,SNHG3的表达量明显上升;对c-Myc进行RNAi实验后,脂质代谢转录因子SREBP-1C的表达量下降。5.通过软件预测发现SNHG3存在很多microRNA的结合位点,其中通过文献查阅发现,miR-93、miR-205/205ab、miR-214、miR-221、miR-24、mi R-338、miR-10abc、miR-128、miR-182可直接调控脂肪酸代谢途径关键转录因子SREBP-1c、其上游调控基因或者下游靶基因。结论:1.SNHG3在HCC组织和细胞中显著高表达,其长度2238nt的可变剪接体为主要存在形式;SNHG3对其染色体位置附近的基因的表达不产生影响,不存在顺式(cis)调控作用。2.SNHG3与细胞的脂质代谢密切相关,SNHG3可能通过介导转录因子SREBP-1c来调控HCC细胞的脂质代谢活动。3.c-Myc可能通过作用于SNHG3的启动子区促进SREBP-1c的表达。!!!4.SNHG3很有可能通过miRNA参与调控SREBP-1c。