研究背景:穿山甲甲片及花胶作为贵重中药材,随着国民生活水平的不断提高,需求亦迅速增加,价格也随着上涨,市场上出现了大量的混伪品,于是,对甲片及花胶的准确鉴定是十分有必要的。传统方法对其基源鉴定难度比较大,DNA分子标记技术对在生物类样品鉴别方面具有的准确性高、重现性好等特点得到了广泛认可,所以本研究应用DNA条形码技术对甲片及花胶进行鉴定。目的:探索合适的DNA提取方法,提取穿山甲生甲片及炮甲片中的DNA,筛选适用于甲片及混伪品鉴别的DNA条形码片段;并针对炮甲片设计微型条形码及引物,对其进行鉴定;使用DNA条形码技术确定广州市售花胶的物种来源。方法:在前人研究基础上,对样品预处理、消化时间等方面进行改进,建立甲片DNA的提取方法;扩增Cyt b基因并进行测序,以检验提取结果。测定了穿山甲的COI片段及Cyt b片段,结合其他已知序列,对穿山甲的DNA条形码序列进行比较分析,计算种内及种间遗传距离,作出barcoding gap图,并构建系统发育树,确定适用于甲片的DNA条形码,并确定甲片正品及混伪品条形码序列的核心单倍型。从穿山甲属动物COI片段及线粒体全基因组中寻找合适的微型条形码区域,并设计引物,进行PCR扩增和测序,考察确定适宜的微型条形码区域。用筛选出的微型条形码对市售穿山甲甲片进行鉴定。筛选设计合适的COI引物对市售花胶样品进行PCR扩增、测序,用BOLD(The Barcode of Life Data Systems)系统的物种鉴定引擎,与数据库中已有鱼类序列进行比对,鉴定出各样品的基源。结果:利用改进的DNA提取方法,从生甲片与炮甲片中提取获得DNA,并通过Cytb基因扩增及测序,证明所提DNA为穿山甲的DNA。从生甲片中,COI序列及Cytb序列均能成功扩增,根据相似性检测结果,邻接法构建系统聚类树的自举检验置信度结果显示基于COI序列,应用DNA条形码技术可以更有效鉴定穿山甲及其混伪品。炮甲片中COI片段不能获得扩增。研究发现穿山甲的COI中一段约150bp的区域在甲片和炮甲片均可获得扩增,通过序列分析,认为其可以作为鉴别甲片及伪品的微型条形码片段。用微型条形码对9份市售甲片成功进行了鉴定,结果显示,其中8份甲片均为马来穿山甲,另1份为中华穿山甲。11份市售花胶样品用引物DK1-CO1和DK1-CO2均可实现扩增,条带清晰、稳定,扩增和测序成功率均为100%;BOLD鉴定结果显示,11份样品来源于3科5种鱼类;这5种鱼类既不是药物专著里规定的正品鱼膘原动物,也不是饮食行业传统认知中的花胶基源。。结论:通过改进的DNA提取方法可实现对生甲片及炮甲片DNA的提取。COI较Cyt b而言是更合适的鉴别甲片正品及混伪品的DNA条形码片段。自行设计的微型条形码片段能有效地对市售甲片及炮甲片进行鉴定。DNA条形码技术与BOLD鉴定系统相结合,可对市售花胶进行准确的基源鉴定。