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目的:1、证实Metrml在正常组和糖尿病外周神经病变模型组大鼠坐骨神经和原代雪旺细胞中的表达。2、观察不同组别大鼠坐骨神经来源的雪旺细胞的增殖能力3、观察不同组别大鼠坐骨神经来源的雪旺细胞中Metml和NGF的表达情况。4、观察siRNA抑制雪旺细胞内源性Metrnl表达后对其增殖和生存能力的影响。6、观察siRNA抑制雪旺细胞内源性Metml表达后对其内源性NGF表达的影响方法:1、大鼠分组、造模SD雄性大鼠12只,体重200-220g(6-8周龄),分笼喂养,自由摄食饮水。随机选取6只设为正常组,剩余大鼠按55mg/kg体重经腹腔注射链脲佐菌素。72小时后测糖尿病组大鼠血糖>16.7mmol/l为糖尿病造模成功。实验期间大鼠自由摄食饮水,每周监测血糖和体重。2、坐骨神经运动传导速度测定大鼠经10%水合氯醛麻醉后固定于实验平台(350mg/kg体重腹腔注射),参照Obrosova等人的方法得到坐骨神经运动传导速度。实验重复3次,结果取平均值。3、原代雪旺细胞培养、纯化及纯度鉴定无菌条件下取STZ造模后3个月病程糖尿病及相应时间的正常大鼠坐骨神经,显微镜下剥除神经外膜,将组织块剪成碎段后移用0.25%胰蛋白酶和0.05%Ⅰ型胶原酶混合溶液37℃消化90min,200目筛网过滤后用终止培养基终止消化,然后1200rpm离心6min,弃上清液。最后用接种培养基重悬后接种于预先用层黏连蛋白和多聚赖氨酸包被的培养板中。细胞贴壁前3天加用阿糖胞苷,3天后换为完全培养基。待细胞生长稳定后通过细胞免疫荧光染色鉴定雪旺细胞并计算其纯度。4、Metml在SD大鼠坐骨神经及原代雪旺细胞中的表达采用免疫组化染色鉴定Metrnl在SD大鼠坐骨神经的表达,采用细胞免疫荧光染色鉴定Metml在原代雪旺细胞中的表达。5、不同组大鼠坐骨神经来源的雪旺细胞的Metml和NGF的表达情况雪旺细胞分为3组:高糖组(培养基中葡萄糖浓度为45mmol/1,雪旺细胞来自糖尿病组大鼠坐骨神经),正糖组(培养基中葡萄糖浓度为5.56mmol/1,雪旺细胞来自正常组大鼠坐骨神经),甘露醇高渗组(培养基中含有5.56mmol/1葡萄糖+39.5mmol/1甘露醇,雪旺细胞来自正常组大鼠坐骨神经)。待细胞生长的融合状态达到80%后,将培养基更换为相应的高糖DMEM基础培养基(葡萄糖浓度为45mmol/1)、正糖DMEM基础培养基(葡萄糖浓度为5.56mmol/1)、甘露醇高渗DMEM基础培养基(培养基中含5.56mmol/1葡萄糖+39.5mmol/1甘露醇)处理48 h后,分别收取细胞和上清液通过Real-Time PCR,Western blot和ELISA检测雪旺细胞Metml和NGF的表达量。6、Metrnl特异性siRNA干扰效果检测取对数生长期的正常组大鼠坐骨神经来源且正糖培养的雪旺细胞,待其生长融合度达到60-70%时,采用Lipofectamine(?)3000将siRNA转入雪旺细胞内,48小时后收集细胞通过Real-Time PCR 和 Western blot 检测干扰效率。7、CCK8法检测细胞增殖能力转染siRNA的雪旺细胞分为两组:siRNA-M-2组和NC组,另外不同组大鼠坐骨神经来源的雪旺细胞按上述方法分为三组:高糖组,正糖组和甘露醇高渗组,分别采用CCK8法在相应时间段测量各组细胞在450nm处的吸光度并绘制生长曲线。8.FACS法检测雪旺细胞凋亡转染siRNA的雪旺细胞分为两组:siRNA-M-2组和NC组,转染48小时后弃上清,换成葡萄糖浓度为5.56mmol/l的DMEM无血清培养基继续培养24小时,收集细胞用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡。结果:1、正常组和糖尿病外周神经病变组大鼠坐骨神经和原代雪旺细胞中均存在Metml的表达。2、与正糖组雪旺细胞相比,高糖组雪旺细胞Metml和NGF表达量均下降,而正糖组与甘露醇高渗组雪旺细胞Metml和NGF表达量无统计学差异。3、与正糖组雪旺细胞相比,高糖组雪旺细胞增殖能力下降,而正糖组与高渗甘露醇组雪旺细胞增殖能力无统计学差异。4、与NC组雪旺细胞相比,siRNA-M-2组雪旺细胞增殖能力下降,但凋亡率无统计学差异,这可能是由于内源性NGF表达升高所致。结论:1、Metml在大鼠雪旺细胞中存在表达且在糖尿病状态下表达下降。2、雪旺细胞Metml沉默后抑制雪旺细胞的增殖,提示后者与糖尿病外周神经功能异常有关。3、雪旺细胞Metml沉默后细胞的增殖能力下降,但不显著增加雪旺细胞的凋亡,这可能与内源性NGF表达上调有关。