基于富G序列及过氧化物模拟酶特性的光学传感器的构建与应用

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光学传感器是具有分子识别功能的接受器,由多种指示剂、染料、抗原和抗体核酸、组织和细胞等构成。它具有高灵敏度和非破坏性的特点,广泛用于生物传感。而随着对基因深入的研究和人类基因全序列测序工作的顺利完成,DNA尤其是富G序列在生物监测以及疾病的预防和诊断方面的应用前景被十分看好。将富G序列应用在光学传感器上来提高传感器的性能,近年来受到了很大的关注。天然酶有很高的催化活性,但其价格昂贵且不易于保存,对储存环境要求很严格。与天然生物酶相比,模拟酶可以通过化学方法制得,其成本低,稳定性好,保存环境温和。3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)是过氧化氢的一种显色底物。过氧化物模拟酶能够催化H2O2氧化TMB。利用G四链体作为结构框架可以设计多种过氧化物模拟酶,近年来受到了科研工作者的青睐。本论文基于富G序列的信号增强以及过氧化物模拟酶特性设计了三个光学生物传感器并成功用于目标物的检测。主要研究内容如下:(一)传统的分裂适配体策略不能直接用于改善基于Th T指示剂取代法的ATP荧光传感器的灵敏度。因为分裂后的ATP适配体对Th T的结合远不如完整的适配体。为了解决这一问题,本文首次利用富G DNA序列增强两个分裂的ATP适配体与Th T的亲和力,并通过增强的分子识别提供更低的检测限、更宽的线性范围和更好的选择性。与完整的适配体/Th T复合物相比,两条富G ATP分裂适配体/Th T复合体具有更高的荧光。ATP会从富G ATP分裂适配体/Th T复合体中置换出Th T,使荧光降低。该传感器的检测限为2 n M,并且已用于15%人血清中ATP的灵敏检测。(二)在该研究中,提出了利用富G DNA和Cu2+构建的G4-Cu2+过氧化物模拟酶用于检测H2S的策略。在H2O2对3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)的氧化过程中,22AG DNA可以提高Cu2+的催化能力,此时22AG DNA作为信号放大器。然而,G4-Cu2+过氧化物模拟酶在与H2S反应后失去了它的酶活性。随着H2S浓度的增加,G4-Cu2+过氧化物模拟酶催化能力逐渐降低,吸光度逐渐下降,溶液颜色从蓝色逐渐变浅甚至无色。基于此,构建了利用富G DNA和Cu2+合成的过氧化物模拟酶用于选择性检测H2S的比色传感器,该方法无需复杂的合成和仪器,其检测限是7.5 n M。该传感器的灵敏度也可以通过降低Cu2+浓度来提高。并已用于人血清样品中H2S的定量检测。(三)本文首次提出了具有富G序列的22AG DNA在无钠钾离子的吗啉乙磺酸缓冲溶液中可以被诱导形成G-四链体,且该G-四链体具有过氧化物模拟酶特性。它们可以催化H2O2氧化TMB生成蓝色产物,实现对H2O2的比色检测。结合葡萄糖氧化酶(GOx)对葡萄糖的特异性催化氧化产生H2O2,以及G-四链体过氧化物模拟酶对H2O2的催化作用,设计了一个酶级联反应用于葡萄糖的比色可视检测。吸光度和葡萄糖的浓度在1?M~1 m M范围内具有良好的线性关系,检测限是0.53?M。另外,由于颜色变化明显,为肉眼检测葡萄糖提供了方便。所设计的生物传感器在人血清葡萄糖检测中表现出令人满意的回收率和准确度。因此,本实验为糖尿病的诊断和预防提供了一种方便、灵敏、有前景的策略。
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