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背景:肿瘤是一种全球性的恶性疾病,发病率逐年上升,死亡率高,严重影响人们的身体健康和生活质量。结肠癌是临床常见的消化道恶性肿瘤,因早期无明显临床症状,未引起人们的注意,就诊时多已是癌症晚期,无法通过手术彻底根除,治疗上以化疗为主。然而,化疗对机体的毒副作用大,价钱较为昂贵,且容易产生耐药性。因此,在中医学宝库中寻找药效明显、毒副作用更小的药物治疗结肠癌,是一个现实且迫切的需求。随着对肿瘤机制研究的不断深入发展,很多研究表明,结肠癌细胞膜表面糖胺聚糖(GAGs)、黏蛋白(MUCs)和糖链唾液酸化修饰的改变,对结肠癌细胞的增殖、迁移、细胞黏附和信号传导等方面有着重要的影响。祖国医学认为,肿瘤的发生发展与中医“痰”病变紧密相关,肿瘤的主要病机之一就是痰凝郁结,所以化痰散结是治疗肿瘤的重要治法。痰具有黏腻重浊的特点,与结肠癌组织中GAGs、MUCs及唾液酸为代表的糖类大分子含量增多或过度修饰具有相似性,均可造成病理性物质积聚,促进肿瘤发展。本实验以常用化痰中药桔梗的主要有效成分桔梗皂苷D(PD)作用于结肠癌细胞HCT116,研究PD对结肠癌细胞GAGs、黏蛋白1(MUC1)和唾液酸糖基转移酶(STs)的影响。本实验将中医痰致病理论与现代医学病理机制相联系,为研究结肠癌提供一种新思路,为发展中医痰致病理论提供一定的实验依据。目的:观察PD对人结肠癌细胞HCT116和人正常结肠上皮细胞HCoEpiC活性的影响;PD干预HCT116细胞后GAGs含量的改变;PD干预HCT116细胞后对硫酸软骨素合成酶(CHSYs)蛋白和mRNA表达水平的影响;PD干预HCT116细胞后MUC1蛋白水平和mRNA水平的改变;人正常结肠上皮细胞HCoEpiC与人结肠癌细胞HCT116中STs的表达差异;PD对HCT116细胞中高表达的STs基因的影响。方法:采用CCK-8法测定浓度为4、8、16、32、64 μM的PD对HCT116和HCoEpiC细胞活性的影响;PD作用HCT116细胞后,提取细胞GAGs,间羟联苯法检测GAGs样品中糖醛酸的含量,高效液相检测GAGs样品中N-乙酰半乳糖胺(GalNAC)含量;采用 Western Blot 和 Real-Time PCR 检测浓度为 6.5 μM、13 μM、26 μM 的 PD 对结肠癌细胞中软骨素合成酶1(CHSY1)、软骨素合成酶2(CHSY2)蛋白水平和mRNA水平的变化;采用Western Blot和Real-Time PCR检测浓度为6.5μM、13 μM、26 μM的PD干预HCT116细胞后MUC1蛋白水平和mRNA水平;采用Real-Time PCR检测HCoEpiC和HCT116细胞中20种STs的表达;采用Real-Time PCR检测浓度为6.5μM、13 μM、26 μM的PD组和空白对照组比较,HCT116细胞中高表达的STs基因mRNA水平有无改变。结果:1.CCK-8实验结果表明,8、16、32、64μM的PD组均能抑制HCT116细胞的生长,且随浓度增加,抑制作用增强。4、8、16μM的PD组对HCoEpiC细胞无明显影响,32、64 μM的PD组对HCoEpiC细胞具有一定的抑制作用。按α=0.05水准,在HCT116细胞中,4μM PD组与空白对照组(P=0.963)差别无统计学意义,8μM PD组与空白对照组(p=0.022)、16 μMPD组与空白对照组(p<0.001)、32 μMPD组与空白对照组(P<0.001)、64 μM PD组与空白对照组(p<0.001)差别具有统计学意义,说明各浓度PD组与空白对照组比较,对HCT116细胞的抑制作用不同;在HCoEpiC细胞中,4 μMPD组与空白对照组(P=0.291)、8μMPD组与空白对照组(p=1.000)、16 μMPD组与空白对照组(P=0.671)差别无统计学意义,32μMPD组与空白对照组(P<0.001)、64μM PD组与空白对照组(P<0.001)差别具有统计学意义,说明PD在较低浓度时对正常结肠上皮细胞无影响,在高浓度时具有抑制作用。根据细胞吸光度,计算细胞抑制率,得出药物作用HCT116细胞48 h后的IC50值为13 μM,HCoEpiC细胞IC50值为37 μM。2.间羟联苯法检测糖醛酸含量,结果表明,PD干预细胞后糖醛酸含量减少。按α=0.05水准,PD组与空白对照组(P<0.001)差别有统计学意义,PD组与实验组相比较糖醛酸含量有差别。3.高效液相检测GalNAC含量,结果表明,PD干预细胞后GalNAC含量减少。按α=0.05水准,PD组与空白对照组(P<0.001)差别有统计学意义,PD组与实验组相比较GalNAC含量有差别。4.通过Western Blot测定PD对CHSY蛋白表达水平的影响,实验结果表明,各浓度组与空白对照组比较,CHSY1和CHSY2蛋白表达均降低。按α=0.05水准,在CHSY1中,6.5 μM PD组与空白对照组(P=0.019)、13μM PD组与空白对照组(p=0.001)、26 μM PD组与空白对照组(P<0.001)差别具有统计学意义;在CHSY2中,6.5 μMPD组与空白对照组(P=0.021)、13 μM PD组与空白对照组(P=0.007)、26μM PD组与空白对照组(P=0.003)差别具有统计学意义。5.Real-Time PCR实验结果表明,与空白对照组比较,CHSY1和CHSY2 mRNA水平在26μM PD组下调,在6.5、13 μM PD组表达无差异。按α=0.05水准,在CHSY1中,6.5μM PD组与空白对照组(P=0.548)、13μM PD组与空白对照组(p=0.103)差别无统计学意义,26 μM PD组与空白对照组(P=0.002)差别具有统计学意义;在CHSY2中,6.5 μM PD组与空白对照组(P=0.977)、13μM PD组与空白对照组(p=0.052)差别无统计学意义,26 μM PD组与空白对照组(P<0.001)差别具有统计学意义。6.Western Blot测定PD对HCTI16细胞MUCI蛋白表达的影响,结果表明,各浓度组与空白对照组比较MUC1蛋白表达水平下调。按α=0.05水准,6.5μM PD组与空白对照组(P=0.007)、13μMPD组与空白对照组(P=0.001)、26 μM PD组与空白对照组(P<0.001)差别具有统计学意义。7.Real-Time PCR检测不同浓度PD对MUC1基因mRNA的表达影响,各浓度组与空白对照组比较MUC1 mRNA表达下调。按α=0.05水准,6.5 μMPD组与空白对照组(P=0.001)、13μM PD组与空白对照组(P<0.001)、26 μM PD组与空白对照组(P<0.001)差别具有统计学意义。8.Real-Time PCR检测HCT116与HCoEpiC细胞STs表达的差异,结果显示,HCT116 细胞与 HCoEpiC 细胞比较,ST3GAL1、ST3GAL6、ST6GALNAC2、ST8SIA3、ST8SIA5高表达(P<0.05),其余基因低表达(P<0.05)。9.Real-Time PCR检测PD干预HCT116后对细胞中高表达的STs的影响,实验结果表明,与空白对照组对比,不同浓度的PD组中ST3GAL1、ST6GALNAC2、ST8SIA3、ST8SIA5 mRNA水平均下调,ST3GAL6在6.5 μM PD组表达无差异,在13、26 μM PD组mRNA表达下降。按α=0.05水准,在ST3GAL1基因中,6.5μM PD组与空白对照组(P=0.026)、13μM PD组与空白对照组(P=0.001)、26μM PD组与空白对照组(P<0.001)差别具有统计学意义;在ST3GAL6基因中,6.5 μM PD组与空白对照组(P=0.855)差别无统计学意义,13μM PD组与空白对照组(P=0.003)、26μM PD组与空白对照组(P<0.001)差别具有统计学意义;在ST6GALNAC2基因中,6.5 μMPD组与空白对照组(P=0.008)、13μM PD组与空白对照组(P=0.004)、26 μM PD组与空白对照组(P=0.001)差别具有统计学意义;ST8SIA3基因中,6.5 μM PD组与空白对照组(p<0.001)、13 μM PD组与空白对照组(P<0.001)、26 μMPD组与空白对照组(P<0.001)差别有统计学意义;在ST8SIA5基因中,6.5 μM PD组与空白对照组(P=0.022)、13 μM PD组与空白对照组(P<0.001)、26 μM PD组与空白对照组(p<0.001)差别具有统计学意义。结论:PD在一定范围内显著抑制人结肠癌细胞的增殖,对人正常结肠上皮细胞影响较小,PD降低结肠癌细胞GAGs的含量,减少CHSY1和CHSY2的表达,降低MUC1的表达,下调 ST3GAL1、ST3GAL6、ST6GALNAC2、ST8SIA3、ST8SIA5 的 mRNA水平。GAGs、MUC1及糖蛋白的唾液酸化修饰可影响肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移,PD作为化痰中药桔梗的有效成分,通过作用于GAGs、MUC1及唾液酸转移酶,影响糖类大分子在肿瘤中的表达与修饰,说明中医痰致病理论与结肠癌细胞相关糖类大分子之间存在一定相关性,化痰治法可改善糖类大分子物质在肿瘤细胞中的表达。