论文部分内容阅读
目的通过真核表达载体pCMV-tag2B将HPV16 E7基因导入人永生化表皮细胞HaCaT,建立稳定表达HPV16 E7的HaCaT-E7细胞系,探讨HPV16 E7癌基因对HLA-Ⅰ类分子表达的影响及相关机制。方法1.稳定表达HPV16 E7 HaCaT细胞系的建立取对数生长期的HaCaT细胞,分别转染pCMV-E7、pCMV-tag2B质粒及设立空白对照组。500ug/ml G418筛选21天后,空白对照组的正常细胞全部死亡,转染组挑选阳性克隆,扩大培养,建立稳定转染HPV16 E7的细胞系HaCaT-E7及空载体对照细胞系HaCaT-pCMV。2.HaCaT-E7细胞系的鉴定取对数生长期正常HaCaT细胞、HaCaT-E7细胞、HaCaT-pCMV细胞,TRIZOL法提取细胞总RNA,以OligdT引物将RNA逆转录为cDNA,以管家基因β-actin为内参照,实时荧光定量PCR检测HPV16E7 mRNA的表达;分别提取正常HaCaT细胞、HaCaT-E7细胞、HaCaT-pCMV细胞总蛋白,经SDS-聚丙稀酰胺（SDS-PAGE）蛋白电泳,Western Blot检测HPV16E7蛋白的表达。3.流式细胞术检测细胞膜表面HLA-Ⅰ类分子的表达取对数生长期正常HaCaT细胞、HaCaT-E7细胞、HaCaT-pCMV细胞,0.25%胰酶消化,含1%牛血清白蛋白的PBS（BSA,PBS-B）调整细胞浓度为107 cells/ml。取100μl细胞悬液,加入20ul抗HLA-ABC-FITC或抗KLH-FITC（同型对照）,混匀后避光静置20min,PBS-B冲洗两遍,400μl PBS-B重悬,上机检测。同理用抗CD46-FITC检测细胞膜表面CD46,做为阳性对照。4.两步法实时荧光定量PCR检测HLA—ⅠmRNA的表达取对数生长期正常HaCaT细胞、HaCaT-E7细胞、HaCaT-pCMV细胞,TRIZOL法提取细胞总RNA,以OligdT引物将RNA逆转录为cDNA。以管家基因β-actin为内参照,实时荧光定量PCR检测HLA-A、HLA-B、HLA-C mRNA的表达。反应结束得到各个基因的循环阈值（Ct值）,用相对定量的方法(2-ΔΔCT)来分析各个基因mRNA表达的改变。结果1.转染HPV16 E7后,500ug/ml G418筛选21天,出现单细胞克隆。实时荧光定量PCR检测HaCaT-E7组细胞HPV16 E7 mRNA的表达,HPV16 E7与内参照β-actin相差约13.27±0.86个循环。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,扩增片段约93bp,与HPV16 E7目的片段相符。Western Blot结果显示,HaCaT-E7组细胞在17KD处检测到HPV16 E7蛋白的表达,与Caski细胞系所表达的HPV16E7位置一致,证实HPV16 E7蛋白在HaCaT-E7细胞中稳定表达,HaCaT-E7细胞系构建成功。2.流式细胞术检测正常HaCaT组、HaCaT-pCMV组、HaCaT-E7组细胞表面HLA-ABC:三组细胞平均荧光强度依次为357.65±15.65、346.82±16.77、182.16±16.47。HaCaT-E7组比正常HaCaT组和HaCaT-pCMV组HLA-ABC的表达显著下降,差异有统计学意义（P＜0.001）。CD46分子表达于人类所有细胞膜表面,其在三组细胞中的表达差异没有统计学意义,表明HPV16 E7癌基因的导入对其它膜表面分子的表达没有影响,HaCaT-E7组细胞HLA-ABC的下降是特异性的。3.实时荧光定量PCR检测正常HaCaT组、HaCaT-pCMV组、HaCaT-E7组细胞HLA-A、B、C mRNA的表达:2-ΔΔCT法计算出各个基因针对内参照β-actin的相对表达量,A、B、C三个位点在HaCaT-E7组的表达与正常HaCaT组及HaCaT-pCMV组相比,差异均无统计学意义（HLA-A,P=0.954;HLA-B,P=0.781;HLA-C,P=0.821）。结论1.通过真核表达载体pCMV-tag2B将HPV16 E7基因导入人永生化表皮细胞HaCaT,成功建立了稳定表达HPV16 E7的人永生化表皮细胞系。2.转染HPV16 E7后,G418筛选21天,细胞膜表面HLA-Ⅰ类分子表达特异性显著降低。3.HLA-Ⅰ类分子表达降低的HaCaT-E7细胞系,其胞内HLA-A、B、C mRNA均未下降,HPV16 E7导致膜表面HLA-Ⅰ类分子表达降低发生在转录后的装配过程。