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背景与目的:CpG DNA具有免疫原性和致病源性,能够诱发关节炎,它可能是细菌关节炎在抗菌素治疗后的骨性关节炎后遗症的一个重要原因。已有文献报道,酪氨酸激酶Syk抑制剂能够显著抑制红斑狼疮小鼠多脏器炎症,并且酪氨酸激酶抑制剂能够有效的治疗类风湿性关节炎。前期研究发现,酪氨酸激酶Syk抑制剂R788能够治疗CpG DNA诱发的关节炎,但酪氨酸激酶Syk在CpG DNA关节炎中的作用及机理仍不清楚。本研究旨在探究酪氨酸激酶Syk在CpG DNA诱发关节炎中的机理,从而建立酪氨酸激酶Syk作为CpG DNA关节炎的治疗靶标,为防止骨性关节炎提供新的思路。方法:为了研究此课题,我们分为以下几部分进行研究:(一)向C57BL/6小鼠关节腔内注射CpG DNA建立CpG DNA诱发关节炎动物模型,分别让小鼠服用酪氨酸激酶Syk抑制剂和安慰剂以及关节腔注射CpG DNA,用苏木精-伊红染色(H&E)观察关节炎症。(二)为了证明TNF-α在CpG DNA诱发关节炎中的作用,我们向C57BL/6小鼠关节腔内注射TNF-α以及PBS(phosphate buffered saline),H&E关节病理切片染色观察TNF-a是否能够诱发关节炎,进一步向TNF-a缺陷小鼠的关节腔内注射CpG DNA,观察是否能够建立关节炎动物模型。(三)1)为了探究酪氨酸激酶Syk抑制剂对单核巨噬细胞经细菌DAN刺激产生的细胞因子的影响,我们体外分离C57BL/6小鼠脾脏单核细胞,用CpG DNA和CpG DNA+酪氨酸激酶Syk抑制剂刺激,收集上清,用ELISA试剂盒检测上清液中的炎性分子TNF-α水平;2)为了进一步了解酪氨酸激酶Syk在CpG DNA刺激单核巨噬细胞中的作用,单核细胞经酪氨酸激酶Syk抑制剂预处理后,用CpG DNA以及IgG分别刺激,蛋白印记(westernblot)方法检测pSyk以及NF-κB中p65的表达水平,免疫荧光方法观察p65进入细胞核的情况;3)为了探究酪氨酸激酶Syk的激活是否与CpG DNA与其配体TLR9的结合有关联,我们用TLR9的阻断剂氯喹(Chloroquine,CQ)预处理单核细胞,用CpG DNA刺激,western blot方法检测pSyk的表达情况。(四)1)为了探究脂筏是否参与了 CpGDNA诱发的关节炎,将单核细胞用CpGDNA在不同的时间点进行刺激,通过免疫荧光方法检测细胞表面脂筏聚集的情况,以及脂筏与酪氨酸激酶Syk、TLR9是否存在共定位;2)进一步探究清除脂筏是否对CpGDNA诱发的关节炎产生治疗作用,我们分别将PBS和MβCD(甲基化β环糊精)处理小鼠然后关节腔注射CpG DNA,H&E关节病理切片染色观察小鼠关节炎症程度。(五)为了探究CpG DNA引起的酪氨酸激酶Syk的活化是否能够影响单核巨噬细胞对CpG DNA的吞噬作用,我们用FITC标记的CpG DNA刺激单核细胞,单核细胞预先用酪氨酸激酶Syk抑制剂处理,用免疫荧光和流式细胞术检测单核细胞对CpG DNA吞噬的影响。结果:本研究首先成功的建立CpGDNA诱发的关节炎模型,通过给小鼠口服酪氨酸激酶Syk抑制剂R788以及关节腔注射CpG DNA,发现酪氨酸激酶Syk抑制剂能够有效的阻止CpG DNA诱发的关节炎模型,并且对已经建立的关节炎模型具有治疗效果。用TNF-α在C57BL/6鼠上也能够建立严重的关节炎模型,但是在TNF-α缺陷鼠上,CpG DNA诱发的关节炎模型不能够有效建立。ELISA检测炎症因子表达水平发现,酪氨酸激酶Syk抑制剂能够降低由CpG DNA刺激单核细胞产生的TNF-α。蛋白印记实验也表明,酪氨酸激酶Syk抑制剂除了降低由CpG DNA引起的pSyk的水平,还能够抑制NF-κB中p65的表达水平。免疫荧光实验也观察到,酪氨酸激酶Syk抑制剂预处理的单核细胞,p65进入细胞核的比例明显低于未刺激组。氯喹实验发现,TLR9的阻断剂氯喹并没有抑制CpG DNA引起的酪氨酸激酶Syk的活化。此外,CpG DNA能够促使单核细胞表面的脂筏聚集,并且发现用CpGDNA刺激单核细胞时,脂筏与酪氨酸激酶Syk、TLR9存在共定位。用MβCD清除脂筏能够减轻CpG DNA引起的关节炎症程度。在用FITC标记的CpG DNA吞噬实验中,免疫荧光和流式细胞都检测到,酪氨酸激酶Syk抑制剂能够降低单核细胞对CpG DNA的吞噬作用。结论:(一)酪氨酸激酶Syk抑制剂可以防治CpGDNA介导的关节炎。(二)酪氨酸激酶Syk抑制剂通过阻止NF-κB信号通路抑制CpG DNA引起的炎性分子的分泌。(三)脂筏参与了 CpG DNA引起的关节炎,清除脂筏可以减轻CpG DNA介导的关节炎。(四)酪氨酸激酶Syk参与了细胞的吞噬过程,抑制酪氨酸激酶Syk的活化(磷酸化)会降低细胞的吞噬活动。