一、食管癌细胞可溶性亚细胞组分的蛋白质组学研究目的肿瘤作为一种体细胞遗传病，其发生涉及多种相关基因的变异，包括癌基因的活化和(或)抑癌基因的失活。食管癌在我国的发病率和死亡率均居于恶性肿瘤的前列，但病因学与发病机制至今不甚明了。食管癌的发生演进是一个多层次、多因素导致的复杂过程，其产生发展涉及多种基因与蛋白的协同作用。近年来有关食管癌的研究主要集中在癌基因／抑癌基因的改变与食管癌的相互关系，如myc、ras、EGFR、Cyclin D1、p53、Rb等。蛋白质组学技术已越来越广泛的应用于致癌机制的研究以及肿瘤相关蛋白的鉴定，我们从永生化食管上皮细胞系SHEE(Shantou Human Esophageal Epithelial cell line)以及由之恶性转化而来的食管癌细胞系SHEEC(Shantou Human Embryonic Esophageal Carcinoma cell line)出发，运用蛋白质组学技术寻找与食管癌密切相关的蛋白基因，进而研究其在肿瘤发生演进过程中的作用机制。材料与方法SHEE与SHEEC细胞在DMEM+F12培养基中正常培养传代，收集贴壁生长的细胞，PBS清洗、离心、裂解，试剂盒分级提取可溶性亚细胞组分蛋白。通过双向凝胶电泳与银染技术分别获得各亚细胞组分的蛋白表达图谱，凝胶图象扫描后进行PDQuest软件分析，比对表达量具有显著差异性的蛋白质点，将这些点取出进行胶内原位酶切，回收酶切片断，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析两种细胞系的肽质量指纹图谱，进行Swiss-Prot蛋白数据库检索以鉴定差异表达蛋白。对其中几种肿瘤发生相关蛋白进行Western Blot分析以及RT-PCR分析，验证其在蛋白以及基因水平的差异表达。结果1．通过MALDI-TOF质谱分析以及蛋白质数据库查询，确定在SHEEC食管癌细胞系中的6种胞浆蛋白表达升高，分别为Cyclin A1，Collagenase 3前体，p56-LCK，Gemin 6，激活信号整合辅助因子1亚基1，Cytochrome P450 2D6；6种胞浆蛋白表达降低，包括PDI，类ADP核糖基化因子10，SDS3蛋白同系物，AmphiphysinⅡ，EF手区包含蛋白1，锌指蛋白ZPR1(倍数≥1.5，匹配度分数＞10~5)。2．7种膜蛋白在SHEEC细胞中表达升高，分别为Bcl-W，Prohibitin，ATP合酶β链，保守低聚物高尔基体组分7，HSP76，Hsp60，Peroxin19；表达降低的10种膜蛋白则包括GAS-1，TNF-α，TNFRSF1，RBBP-9，GAS-6，镁离子转运体MRS2L，PDI A3前体，γ-2tubulin，G21蛋白，CD87抗原(倍数≥1.5，匹配度分数＞10~5)。其中TNF-α在两种细胞系中的表达有明显差异(倍数=2.6，匹配度分数＞10~6)。3．10种核蛋白在SHEEC细胞中表达升高，包括BRE，Cyclin A，Prohibitin，PML，β-Pix，AIP22，泛素蛋白连接酶E3C，TFⅢC63，锌指蛋白306，Copine-8；而另外10种表达降低的核蛋白则包括PMS2，Max蛋白，HSP76，P53诱导蛋白10，含EF手区蛋白1，NIP3样蛋白X，鸟苷酸结合蛋白αq，SIR2样蛋白2，细胞分裂蛋白激酶6，26S蛋白酶调节亚基6A(倍数≥1.5，匹配度分数＞10~5)。其中Cyclin A，Prohibitin，PML与PMS2(倍数＞1.5，匹配度分数＞10~6)，BRE(倍数=2.3，匹配度分数＞10~8)。4．Western Blot分析验证差异显著蛋白在SHEE与SHEEC细胞中的表达，BRE，Cyclin A，Prohibitin，PML在SHEEC细胞中的表达量高于SHEE细胞(P＜0.05)，TNF-α，PMS2在SHEEC细胞中的表达量低于在SHEE细胞中的表达量(P＜0.05)，验证了蛋白质组学部分实验结果；另外，p53在SHEEC中表达下降(P＜0.01)而TNF-R1上升(P＜0.01)。5．RT-PCR分析差异表达蛋白的转录水平差异，SHEEC细胞中BRE，Cyclin A，Prohibitin的mRNA水平升高(P＜0.05)，TNF-α，PMS2的mRNA水平无显著变化(P＞0.05)；另外，p53在SHEEC中转录下降(P＜0.01)而TNF-R1上升(P＜0.01)。结论1．系统鉴定出各亚细胞组分的肿瘤相关性标记物，包括6种在SHEEC细胞表达升高与6种表达降低的胞浆蛋白，7种SHEEC中表达升高与10种表达降低的膜蛋白，10种SHEEC中表达升高与10种表达降低的核蛋白，可作为潜在的肿瘤标志物为食管癌的诊断及治疗提供靶点。2．发现BRE，TNF-α，Prohibitin，CyclinA，PML与PMS2这6种序列匹配度较高的蛋白差异表达明显；其中BRE蛋白差异尤为显著且具有较高的匹配度与重复性，为后续从BRE蛋白出发深入探讨其与食管癌之间的关系提供了理论依据。3．免疫印迹技术与RT-PCR验证以上差异表达蛋白在两种细胞系内的差异，证明上述差异蛋白与食管癌癌变过程具有一定的相关性。二、BRE在食管癌细胞系中的初步研究目的BRE(Brain and Reproductive organ-Expressed)是一种功能多样的蛋白，在两种细胞系中表达的显著差异提示其可能与食管癌发生过程有关。通过RNA干扰技术沉默BRE基因表达，研究其在食管癌细胞系中的潜在作用机制。材料与方法SHEE与SHEEC细胞用DMEM+F12培养基在4孔培养板内加入盖玻片进行培养，用以进行BRE-siRNA转染，转染24h后倒置显微镜观察细胞形态，TRIzol溶液消化细胞后提取对照组与转染组细胞总RNA，RT-PCR检验转染效果，Western Blot技术对BRE以及肿瘤相关蛋白的翻译水平进行检测，并利用免疫荧光细胞化学技术检测其在细胞内的定位与表达情况。结果1．运用RNA干扰技术封闭BRE基因的表达，RT-PCR与Western blot结果证明，BRE基因的转录水平(P＜0.01)与翻译水平(P＜0.01)均显著下降。2．BRE基因沉默后，RT-PCR扩增结果表明，prohibitin在SHEE(P＜0.05)与SHEEC细胞(P＜0.01)中的转录降低，CyclinA在两种细胞中的转录水平显著下降(P＜0.01)，p53的mRNA水平则无显著性差异(P＞0.05)；3．Western blot结果显示，阻断BRE基因表达导致prohibitin表达下调(P＜0.01)，p53的蛋白表达则提高(P＜0.01)，而CyclinA与CDK2的表达同时下降(P＜0.01)。4．免疫荧光实验显示，BRE主要分布于胞浆近核膜区，在细胞核内也有表达，转染处理后在两种细胞的胞浆与胞核内表达均下降；prohibitin胞核内散在表达，同时存在于线粒体内，转染处理后表达下调；p53与Cyclin A则主要分布于细胞核内，p53在转染处理后的两种细胞系内表达增强，而cyclinA表达则有所减弱。结论1．设计的BRE基因干扰序列有效的封闭BRE基因在两种细胞系中的表达。2．BRE基因沉默导致肿瘤相关蛋白如prohibitin，p53，CyclinA与CDK2蛋白与核酸水平的变化，结果通过Western blot与RT-PCR验证。3．推测BRE基因在食管癌发生发展中发挥作用，可能参与抵抗细胞凋亡以及促进细胞生存与增殖等不同作用环节。