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目的:CD25和CCR4在人皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T cell lymphoma,CTCL)上呈高表达。我们的前期研究结果表明,以CD25为靶点的人白介素-2免疫毒素(human hIL2 fusion toxin,hIL2)、以CCR4为靶点的抗人CCR4免疫毒素(human CCR4immunotoxin)能够杀伤CTCL细胞。由于单一靶点亲和力较低,使得两种免疫毒素疗效有限,因此,本实验为了增强免疫毒素与CTCL的亲和力,提高免疫毒素对CTCL杀伤,构建了hIL2-anti-hCCR4/anti-hCCR4-hIL2双特异性免疫毒素。方法:1.以二价anti-hCCR4免疫毒素和二价hIL2免疫毒素为基础,构建DT-hIL2-anti-hCCR4/anti-hCCR4-hIL2的表达载体,利用电转化的方法将表达载体导入到毕赤酵母中,经甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定表达产物,镍柱和离子交换柱对免疫毒素进行纯化;2.利用不同浓度的免疫毒素处理体外培养的人CD25~+CCR4~+T细胞株HUT102/6TG,细胞增殖抑制试验检测双特异性免疫毒素对HUT102/6TG细胞的体外抑制能力,流式细胞术检测hIL2-anti-hCCR4/anti-hCCR4-hIL2双特异性免疫毒素与102/6TG细胞的结合能力;3.尾静脉注射HUT102/6TG细胞建立荷瘤小鼠模型,腹腔注射不同浓度的免疫毒素,连续注射10天,生存试验检测模型小鼠的存活时间,病理剖检和组织切片观察肝脏病变,评价双特异性免疫毒素的体内生物活性。结果:1.SDS-PAGE和Western Blot结果表明,在86kDa处出现了与预期大小一致的目的条带,证明双特异性免疫毒素成功表达;2.CellTiter-Glo?发光法检测结果表明,双特异性免疫毒素能够抑制HUT102/6TG细胞的增殖,且呈浓度依赖性;3.流式细胞术检测结果表明,hIL2免疫毒素、anti-hCCR4免疫毒素、hIL2-anti-hCCR4免疫毒素和anti-hCCR4-hIL2免疫毒素的Kd值分别为60.381 nM、21.932 nM、12.305 nM和19.698nM,hIL2-anti-hCCR4免疫毒素和anti-hCCR4-hIL2免疫毒素的结合能力高于hIL2免疫毒素和CCR4免疫毒素;4.生存试验检测结果表明,经hIL2免疫毒素、CCR4免疫毒素、hIL2-anti-hCCR4免疫毒素和anti-hCCR4-hIL2免疫毒素治疗的模型小鼠的中位存活期分别为32 d、39 d、49 d和63 d;5.病理剖检和组织切片结果表明:这两种双特异性免疫毒素对CD25~+CCR4~+肿瘤细胞的抑制作用均强于anti-hCCR4免疫毒素和hIL2免疫毒素。结论:1.双特异性免疫毒素在毕赤酵母中成功表达,经镍柱和离子交换柱纯化后可在1L的培养液中获得7mg的双特异性免疫毒素;2.hIL2免疫毒素、anti-hCCR4免疫毒素、hIL2-anti-hCCR4免疫毒素和anti-hCCR4-hIL2免疫毒素对CD25~+CCR4~+T细胞株Hut 102/6TG均有杀伤作用,hIL2-anti-hCCR4免疫毒素和anti-hCCR4-hIL2免疫毒素的杀伤作用强于hIL2免疫毒素和CCR4免疫毒素,且hIL2-anti-hCCR4免疫毒素的杀伤作用最好。