蛋白质的磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰形式之一。在生物体液或组织中,许多低丰度内源性的磷酸化蛋白/多肽是具有高度特异性和临床灵敏性的生物标志物,这些生物分子对多种疾病的诊断及其病理的阐释可能提供有价值的信息。由于蛋白质磷酸化过程动态可逆且丰度低,从复杂的生物样品中通过质谱直接来检测磷酸化蛋白/多肽仍然是一个巨大的挑战。亲和纳米材料因具有大的比表面积、丰富的活性亲和位点及其独特的理化结构,在磷酸化蛋白/多肽的分离和富集方面已经引起了广泛的关注,并成为目前磷酸化蛋白质组学分离、富集和鉴定方面的研究热点。因此,本论文针对低丰度的磷酸化蛋白质/多肽在质谱分析中所面临的化学计量低、离子化效率低以及信号易受高丰度非磷酸化蛋白/多肽抑制等难点问题,开展了一系列的研究工作。通过设计和发展新型的磁性亲和纳米探针,选择性地富集磷酸化蛋白/多肽,建立高效、简单、快速和方便的磁分离过程,并将磁性亲和纳米探针应用于实际生物样品中磷酸化蛋白/多肽的分离富集,取得了令人满意的分离富集效果。本论文由绪论(第一章)和研究工作(第二～六章)组成,研究工作主要涉及两类新型亲和探针,即磁性尖晶石类(第二、三和四章)和稀土基类的亲和探针(第五和六章),面向应用于对磷酸化蛋白/肽进行选择性富集而展开研究,具体内容如下:(1)简述了生物质谱技术的发展史,包括质谱仪的基本构造和工作原理,着重介绍基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)及其基质的选择,并对蛋白质/多肽组学研究及其引申出的磷酸化蛋白质/多肽组学的研究意义进行阐述,重点对磁性亲和纳米探针在磷酸化蛋白/多肽富集中的应用作了概述,归纳了近年来磷酸化蛋白/多肽富集新技术、新方法的应用,并对富集过程采用的磁性材料进行分类总结。最后,简要地介绍了本论文的研究思路。(2)可逆的蛋白质磷酸化作用在各种生物过程中起着非常重要的作用,特别是异常的磷酸化作用是导致人类疾病的原因或结果。我们通过合成简单、低廉的磁性Fe3O4纳米簇(Fe3O4MNCs)亲和探针,从人唾液样中成功地选择性富集和萃取内源性磷酸化肽段,并通过MALDI-TOFMS或二级质谱(MS/MS)来进一步说明和鉴定。制备的磁性纳米簇材料的物化性质通过SEM、TEM、XRD、EDX和SQUID等技术来表征。基于材料的高亲和性、快速分离、良好的生物相容性、优异的分散性以及特异性吸附磷酸化肽等特性,Fe3O4 MNCs可以从标准磷酸化蛋白和脱脂牛奶的胰蛋白酶酶解液,以及人唾液样中有选择性地和有效地萃取磷酸化肽。此外,我们还将该探针应用于磷酸化蛋白快速和有效的纯化和富集过程。Fe3O4 MNCs亲和探针整合了固体路易斯酸的功能和自身固有的磁性能为一体,且采用“双经济”(时间和费用)的合成策略,可以潜在地应用于大规模的内源性磷酸化蛋白质组学的研究。(3)通过简单溶剂热法合成尖晶石型磁性锰铁氧体(MnFe2O4)微球,将其作为一种新型吸附剂,用来选择性富集和有效分离磷酸化肽。这种MnFe2O4磁性亲和微球(MAMS),粒径均一,呈窄粒径分布,并显示出强的饱和磁化值及超顺磁性,便于磁分离应用,使操作更为简便。我们还探讨了 MnFe2O4微球的可能形成机理,在Fe3+和Mn2+分别作为铁源和锰源,同时作为双前驱体时,形成的是MnFe2O4微球;而单一的Fe3+和Mn2+作为前驱体时,则分别形成Fe3O4微球和MnOOH纳米片状结构,这些球状/片状纳米结构材料的形成过程,分别可以通过二次重结晶/Ostwald熟化机理来解释。MnFe2O4 MAMSs亲和探针在水溶液中展现出较优异的分散性,可以完成快速磁分离,且具有良好的可重复循环性。基于MnFe2O4中金属价态(Fe3+和Mn2+)和磷酸化肽中的磷酸基团(PO43-)之间的强配位作用,该探针对磷酸化肽具有高度选择性。实验还通过从β-casein及其与BSA胰蛋白酶酶解液的混合液(富含非磷酸化肽)中有效地富集磷酸化肽,证明了其高特异性吸附磷酸化肽的性能,并进一步应用于脱脂牛奶样中胰蛋白酶酶解液和复杂的生物样品人血清中磷酸化肽的富集。因此,可以预见MnFe2O4亲和探针材料在磷酸化蛋白组学研究中具有诱人的应用前景。(4)通过简便的溶剂热法制备了一种具有可控形态和尺寸的新型多功能磁性CuFeMnO4纳米球亲和探针(NSAP),并提出了该均匀NSAP颗粒的可能生长机制。这种纳米结构的亲和探针结合了 Cu2+,Fe3+和Mn2+的优异特征,它们的多功能性能通过与肽的羧基和胺基之间的超强配位能力(Cu2+和Fe3+),与磷酸化肽中的磷酸基团之间的特殊亲和力(Fe3+和Mn2+),以及良好的磁场响应性来体现。我们评估了 CuFeMnO4 NSAP从复杂生物样品中高效富集和快速磁分离低丰度肽(中性条件)和有效选择性捕获磷酸化肽(酸性条件)的潜力,尤其是探索了该NSAP探针用于从通过ZnO纳米颗粒刺激不同时间后的A549细胞裂解液中高度选择性分离并捕获磷酸化肽的可行性,从而提出了一种基于CuFeMnO4的研究经过外源物刺激后,细胞信号通路中磷酸化蛋白/磷酸化肽变化的新策略。(5)成功地合成了类似荔枝壳状核-壳结构的磁性磷酸镥(Fe3O4@LuPO4)亲和微球。基于磁性LuPO4亲和微球对磷酸化肽的特异亲和作用及其自身优异的快速磁分离的性质,将其应用于选择性富集磷酸化肽的研究并用于MALDI-TOFMS分析。通过从标准蛋白(β-酪蛋白)和复合样品(β-酪蛋白和牛血清白蛋白的不同摩尔比:1:10-1:50)的胰蛋白酶酶解液及混合液、以及真实生物样品(纯鲜牛奶样和人体血清样)选择性富集磷酸化肽来验证所制备微球的富集性能。结果表明,磁性LuPO4亲和微球对磷酸化肽的富集能力非常令人满意,可以选择性地捕获磷酸化肽且MS信号急剧增强,并且可通过质谱图中存在的分辨率较差的亚稳态离子峰进行可靠鉴定。Fe3O4@LuPO4亲和微球选择性富集磷酸化肽的研究,为大规模的磷酸化蛋白质组学分析提供了强有力的研究方法。(6)分别通过共沉淀法和溶剂热法制备出两种新型的铈基纳米复合材料(P-CCS和CSF)。并基于新型探针对磷酸化肽的亲和作用提出一种顺序组合的富集策略,不仅可以有效地将磷酸化肽与非磷酸化肽分离,而且可以进一步区分单磷酸化肽和多磷酸化肽。此外,这两种CeO2掺杂的亲和探针还表现出催化去磷酸化过程的性质,可以作为一种去磷酸化过程的催化剂。具体地说,CSF探针用于捕获多磷酸化肽,而P-CCF探针辅助捕获单磷酸化肽。通过这种方式,成功实现了单和多磷酸化肽的有效分步富集。因此,这种组合策略可以作为一种良好的对全磷酸化肽进行分离富集的替代方式。