调控骨性关节炎发生潜在关键基因的筛选和验证

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背景:骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种十分常见的骨关节退行性疾病,是导致成年人致残的主要原因之一。OA目前的病理机制主要被定义为发生在关节软骨上的改变。但是其具体的分子机制仍然是不够明确的。而生物信息学技术可以很好的帮助我们探索了解疾病的内在机制,为我们进一步深入了解OA,为治疗OA创造条件。目的:本研究旨在探索骨关节炎发生发展的潜在关键基因以及其在软骨损伤中的内在联系。方法:通过GEO平台获得所需的OA基因数据库,处理筛选得到差异表达基因(筛选条件:|log FC|≥1.0和adj.p.value<0.05)。再通过DAVID在线网站对处理后的数据进行GO和KEGG富集分析。通过Cytoscape程序构造差异表达基因的蛋白质相互作用网络(PPI)并通过内置程序MCODE筛选出最重要的模块及潜在关键基因。然后进一步分析潜在关键基因的主要功能及相关通路,并探究潜在关键基因在OA软骨破坏中的关系。收集深圳市第二人民医院骨折病人股骨头及OA患者的膝关节软骨标本来分离培养软骨细胞。通过细胞形态学的观察、甲苯胺蓝染色实验证实其确实为软骨细胞。通过免疫荧光染色检测软骨细胞内COL I和COL II表达水平。通过细胞凋亡染色实验检测正常和OA软骨细胞的死亡情况。通过q RT-PCR实验分析潜在关键基因在软骨细胞中的相关表达水平。结果:本研究通过分析共从OA发病机制中鉴定出265个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)并成功构建了它们之间的蛋白网络结构图。然后通过模块分析得到了四个重要模块以及模块中4个潜在关键基因。潜在关键基因中MAPK-14、PTPRC、PTPN12在OA中高表达,而B9D1在OA中低表达。实验研究发现,所培养细胞经甲苯胺蓝染色后胞浆呈紫蓝色,结果为阳性,表明我们所培养的细胞为软骨细胞。而与正常软骨细胞相比,OA软骨细胞高表达COL I蛋白,低表达COL II蛋白。并且OA软骨细胞炎性坏死较正常软骨细胞明显增加,细胞膜明显被破坏。而通过q PCR检测正常软骨细胞以及OA软骨细胞中四种潜在关键基因的m RNA表达水平差异,发现OA软骨细胞中MAPK-14、PTPRC及PTPN12表达量显著高于正常软骨细胞而B9D1的表达量显著低于正常软骨细胞。此外,通过查阅文献发现4种潜在关键基因中MAPK-14被研究证明在OA发生发展中起到重要的作用。结论:(1)通过生物信息学筛选得到OA发病机制中4个潜在关键基因,分别是MAPK-14、PTPRC、PTPN12和B9D1;(2)OA软骨细胞基质合成分解代谢失衡,细胞膜破坏增加,这可能与MAPK-14高表达促进OA软骨细胞的死亡有关;(3)MAPK-14、PTPRC、PTPN12以及B9D1与OA发生发展的关系最为密切,调控这些关键基因的表达可为OA的治疗研究提供潜在的参考靶点。
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