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丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)作为我国的传统大宗药材之一,主要用于治疗心脑血管等疾病。丹参亲水性成分的亲水性特性更加符合我国传统中药水煎剂的用药特点而深受关注。植物PsbD基因对稳定类囊体膜上PSII复合体发挥重要作用而影响植物的光合作用。植物通过光合作用产生的光合产物为次生代谢物提供能量和前体物质,次生代谢从几个主要分支点与初生代谢相连接,因此,光合作用产物的多少直接影响下游的次生代谢。本研究以丹参无菌苗为试验材料,研究了过表达SmPsbD对丹参光合作用及其产物合成的影响,分析了引起产物合成量变化的原因,进一步探讨了光合作用产物对丹参中酚类化合物生物合成的影响及其机理。取得的主要结果如下:1.明确了丹参SmPsbD的进化关系及其组织特异性。利用MEGA7.0对丹参SmPsbD的氨基酸序列进行进化树分析,结果表明,目的基因基本遵循由低等藻类植物到高等双子叶植物的进化关系。利用RT-qPCR技术检测了丹参SmPsbD在开花期丹参的根、茎、嫩叶、成熟叶以及花中的转录水平表达,发现该基因在根中不表达,只在地上组织中表达,表达水平依次为:成熟叶>嫩叶>茎>花。2.成功获得了丹参SmPsbD过表达转基因植株。构建丹参SmPsbD过表达重组质粒,利用根癌农杆菌GV3101介导的植物遗传转化体系获得了阳性转基因植株。p CAMBIA1304载体和过表达SmPsbD转基因植株相应的遗传转化效率分别为18.3%和15.0%。利用RT-qPCR技术分析过表达转基因植株中SmPsbD的相对表达量,结果显示,农杆菌介导的遗传转化提高了SmPsbD的转录水平。3.分析了丹参SmPsbD过表达转基因植株的转录水平变化。比较丹参SmPsbD过表达转基因植株与野生型丹参的转录组发现,共产生11354个差异表达基因(DEGs)(FC≥2和FDR≤0.001),其中5084个DEGs上调,6270个DEGs下调。对DEGs进行KEGG富集分析(P-value≤0.05)发现,DEGs主要富集在以下几类相关代谢途径中:与光合作用相关的代谢通路,如“光合作用”、“光合作用-天线蛋白”以及“卟啉和叶绿素代谢”;与信号转导相关的代谢通路,如“植物MAPK信号通路”;与光合作用产物相关的代谢通路,如“淀粉和蔗糖代谢”;与次生代谢相关的代谢通路,如“苯丙氨酸代谢”、“苯丙烷生物合成”、“酪氨酸代谢”、“类黄酮生物合成”等代谢途径。进一步利用Map Man软件对DEGs进行代谢途径可视化分析,其结果与转录组KEGG富集分析一致,即与光合作用及其光合产物相关的途径有光合作用光反应、蔗糖-淀粉代谢、氨基酸代谢、脂代谢以及TCA循环等,与次生代谢相关的途径有类黄酮代谢、萜类代谢以及苯丙氨酸和酚类代谢等。利用RT-qPCR技术对转录组数据中与光反应相关的基因表达进行验证,发现RT-qPCR与RNA-seq的分析结果趋势一致,说明转录组数据可靠。4.明确了过表达SmPsbD引起了丹参代谢物合成的差异。比较SmPsbD过表达转基因植株与野生型丹参的代谢组差异(VIP≥1且FC≥1.2或FC≤0.83),发现有404个差异代谢物,其中278个代谢物含量增加,126个代谢物含量降低。利用metaboanalyst3.0软件对差异代谢物进行KEGG富集分析,发现显著富集的代谢途径归为2类:与初生代谢相关的代谢途径,包括“氨基酸生物合成”、“磷酸戊糖途径”、“泛酸和Co A生物合成”以及“糖类生物合成”;与次生代谢相关的代谢途径,包括“酪氨酸代谢”、“苯丙烷生物合成”、“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成”、“芥子油苷生物合成”、“植物次生代谢生物合成”、“植物激素生物合成”、“来源于莽草酸途径的生物碱生物合成”以及“抗坏血酸和醛酸代谢”等。5.揭示了SmPsbD对丹参光合作用及其产物的调节作用。与野生型相比,丹参SmPsbD过表达转基因植株中叶绿体数目、叶绿素含量、光合作用参数以及叶绿素荧光参数均显著增加,光合作用能力增强,光合作用产物含量提高。结合转录组DEGs发现,叶绿素生物合成过程中相关酶基因的表达量上调可能是叶绿素含量增加的原因。叶绿体数目增加、叶绿素含量增加、植株光合作用能力增强,以及初生代谢相关途径(如TCA循环、蔗糖-淀粉代谢以及莽草酸和分支酸代谢途径)关键酶基因的表达上调可能是光合作用产物含量提高的原因。6.揭示了SmPsbD对丹参酚类化合物生物合成的调节作用。与野生型相比,过表达丹参SmPsbD促进了丹酚酸B、迷迭香酸、总酚和总黄酮等酚类化合物的生物合成与积累。过表达SmPsbD转基因植株中丹酚酸B、迷迭香酸、总酚和总黄酮化合物的含量分别是野生型的1.95～2.43倍、6.57～9.38倍、2.20～3.67倍和1.87～3.39倍。酚类化合物生物合成量增加的主要原因为:一方面是莽草酸和分支酸代谢途径中初生代谢物(莽草酸、苯丙氨酸、酪氨酸等)的生物合成积累增加为次生代谢提供了足够的底物,另一方面是过表达SmPsbD上调了酚类化合物生物合成过程中关键酶(PAL、4CL、RAS、CYP98A14、CHS、FLS、DFR以及LAR等)基因的表达。本研究从生理水平、转录水平和代谢水平揭示了SmPsbD对丹参光合作用及其产物的影响,以及光合作用产物对酚类次生代谢物生物合成的正向调节作用,为通过分子手段提高丹参产量提供了理论依据,也为丹参活性成分的代谢调控奠定了基础。