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重组工程即为重组介导的基因工程,是指采用λ噬菌体来源的重组酶催化DNA之间的同源重组,因此,也称之为λRed重组工程。该技术由于操作简单,快速高效而成为实行DNA克隆和DNA修饰的一种常用基因工程手段。单链寡核苷酸重组工程可以在细菌基因组实行多个位点的同步编辑,相比传统的重组工程具有更加高的基因编辑效率。CRISPR-Cas系统,其中CRISPR是成簇规律间隔的短回文重复序列,而Cas是CRISPR相关蛋白,该系统正迅速成为从细菌到人类细胞系的基本编辑策略。CRISPR-Cas系统的特征在于具有几乎相同序列的定向重复,这些重复序列之间的间隔序列,被发现和很多能够侵入细菌的噬菌体DNA的部分序列相同,约50%的细菌和80%的古细菌通过CRISPR-Cas这一获得性免疫系统来防御病毒和其他入侵的核酸。CRISPR 系统中来自Streotococcus pyogenes SF370 TypeⅡCas9蛋白研究最为透彻,应用最为广泛,该系统由于能够切割DNA,并且切割序列的特异性可由crRNA的序列所决定,因此成为了理想的基因编辑工具。本文的第一个研究内容是将寡核苷酸重组工程和CRISPR-Cas9系统联合应用于大肠杆菌引发酶DnaG基因组编辑。2013年,重组工程和CRISPR-Cas9相结合首次应用于大肠杆菌及至微生物的基因组编辑,大肠杆菌引发酶DnaG参与了 DNA复制,其报道的Q576A和K580A单突变体提高了 DNA重组效率,但没有报道Q576AK580A双突变体,也没有报道寡核苷酸重组效率的比较,我们希望寡核苷酸和CRISPR/Cas9技术相结合简便、快捷地实现单个突变和双突变。首先,本研究构建了cas 表达质粒和sgRNA表达载体,包括基于高拷贝pMB1复制子的cas9表达质粒,基于低拷贝p15A复制子的cas9表达质粒,基于高拷贝pUC复制子的sgRNA表达载体和基于低拷贝pBBRI复制子的sgRNA表达载体。在进行转化效率测定后,选择基于p15A复制子的cas9表达质粒和基于pUC复制子的sgRNA表达载体组成的系统用于进一步研究,基于pUC复制子的sgRNA表达质粒设计为含有I-SceI归巢核酸内切酶及其切割位点,使其成为自剪切载体。此后,将寡核苷酸和sgRNA表达载体共同转化到含有重组工程和CRISPR-Cas9系统的大肠杆菌感受态细胞中,通过对转化子特定区域的PCR和DNA测序比对,成功地获得了 Q576A和K580A单突变体,命名为E.coliLS3513和E.coli LS3516,单突变效率分别达到40%和100%,菌株E.coli LS3513和E.coli LS3516中sgRNA表达质粒的消除效率是100%和44%。然而经过各种尝试没有获得Q576A和K580A双突变体,仅仅得到了和丙氨酸(Ala)在结构上相似的疏水性氨基酸缬氨酸(Val),命名为E.coliLS3519V,突变效率达到5%,sgRNA表达质粒的消除效率是70%。此外,苏氨酸(Thr)也是在突变过程中被高频率获得的氨基酸,命名为LS3519T,突变效率达到73%,sgRNA表达质粒的消除效率是46%。本研究的第二个部分是涉及N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)酶催化相关前体生物合成相关的酶的基因工程改造。Neu5Ac在生物大分子的末端发现并参与生物体内的许多生理反应,是抗流感药物扎那米韦中使用最多的中间体。ppsA和csrB是参与Neu5Ac前体磷酸烯醇式丙酮酸生物合成的两个基因,通过偶联寡核苷酸重组工程和CRISPR-Cas9系统将ppsA和csrB基因的启动子置换为T7启动子,我们获得了pps 基因区域单一插入T7启动子菌株E.coli LS3561,突变效率达到5%,csr 基因区域单一插入T7启动子菌株E.coli LS3571,突变效率达到100%,ppsA和csrB基因区域同时插入T7启动子菌株E.coli LS3581,突变效率达到 10%,并且 E.coli LS3561,E.coli LS3571,E.coli LS3581 中 sgRNA 中的消除效率分别是100%,2%和84%。此外,我们构建了 p15A质粒骨架的自剪切载体pLS3550并运用于cas9表达质粒pLS3535的消除,成功消除了cas 表达质粒消除,效率分别达到21%,24%和41%。此工程菌株有望提高Neu5Ac酶促催化的产量。