论文部分内容阅读
结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是胃肠道恶性肿瘤中常见的一类癌症，其发病率在常见癌症中排名第三。CRC是一种侵袭性较强的恶性肿瘤，极易发生转移，转移阶段的CRC治疗方法主要包括传统化疗、放疗和靶向治疗。大多数针对CRC治疗的靶向药物主要以表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）和血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）单克隆抗体为主，包括贝伐珠单抗、西妥昔单抗和帕尼单抗等。在临床获益方面，靶向药物与化疗的联合已达到良好的治疗效果。例如，转移性结直肠癌（Metastatic colorectal cancer，mCRC）患者的中位生存期可延长至30个月以上。然而，长期治疗会引起肿瘤内的异质性，原发性耐药和获得性耐药严重限制了靶向治疗的有效性。肿瘤的耐药机制非常复杂，通常涉及靶基因的突变或旁路信号通路或下游信号分子的激活。磷脂酰肌醇3-激酶蛋白家族（Phosphatidylinositol-3kinase，PI3K）是细胞内脂质激酶的成员，参与细胞存活、增殖和分化的调控。在mCRC中，PI3K/蛋白激酶B（Protein kinase B，Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mechanistic target of rapamycin，mTOR）信号通路起到了至关重要的作用。近来，瑞戈非尼作为新型的酪氨酸激酶抑制剂在mCRC的治疗中疗效显著，具有较强的抗肿瘤血管生成作用，提高结直肠癌患者的生存率。但研究发现瑞戈非尼对PIK3CA突变的mCRC患者疗效尚具有局限性。目前瑞戈非尼在PIK3CA突变的mCRC患者中的耐药机制尚不清楚。
研究目的：
本研究旨在探究PI3K各亚单位在转移性结直肠癌的变化分析，PIK3CA突变在转移性结直肠癌中的作用以及对瑞戈非尼产生耐药的分子机制,为转移性结直肠癌的治疗提供循证依据，并为新药筛选提供新的治疗方向。
研究方法：
1、收集CRC患者的100个肿瘤样品组织，根据其患者临床分期，分为早期肿瘤和中晚期肿瘤，运用TCGA数据分析比较不同阶段PI3K各亚单位的mRNA表达水平，查找随临床进展水平显著升高的基因。同时对早期结直肠癌与转移性结直肠癌组织进行免疫组化分析,结合随访结果,对两组结直肠癌的各临床病理特征因素进行单因素分析,探讨该PI3K亚单位对结直肠癌患者的影响。2、培养HCT-116、SW480细胞株，建立该PI3K亚单位高表达细胞系,用CCK-8试验绘制瑞戈非尼治疗后HCT116细胞系的生长曲线,流式观察分析比较瑞戈非尼处理转染后的细胞与对照组细胞凋亡情况,并用Western blot、实时定量PCR予以验证；再次运用TCGA数据分析伴随该PI3K亚单位高表达的CRC患者密切相关的细胞凋亡抑制基因，免疫组化等方法检测相关抑制基因该PI3K亚单位的表达情况，以明确该PI3K亚单位与瑞戈非尼耐药的关系及分子作用机制。
研究结果：
1、TCGA数据库分析提示，PIK3CA在转移性结直肠癌中mRNA水平显著升高；
2、PIK3CA免疫组化提示PIK3CA在转移性结直肠癌中的表达水平明显高于早期结直肠癌组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
3、对实验组细胞与对照组细胞行RT-PCR检测，结果发现HCT116、SW480细胞PIK3CA mRNA表达量均高于对照未转染组（P＜0.05）。Western blotting检测蛋白表达结果发现转染组PIK3CA蛋白表达明显高于对照组。
4、流式细胞检测结果显示PIK3CA低表达的结直肠癌细胞在同浓度的瑞戈非尼药物的作用下，较PIK3CA高表达的细胞呈现出对肿瘤细胞更加明显的早期调亡诱导效应。
5、瑞戈非尼处理PIK3CA高表达的结直肠癌细胞，RT-PCR检测结果显示PIM2、IAK、TACC1及IFR的上调与结直肠癌耐药相关性不明显，KPNB1与瑞戈非尼耐药存在显著相关性（P＜0.05）。
6、KPNB1免疫组化检测结果提示KPNB1在PIK3CA高表达的结直肠癌中的表达水平明显高于PIK3CA低表达的结直肠癌组织，差异具有统计学意义（P＜0.05），可能是介导瑞戈非尼耐药的关键分子之一。
研究结论：
转移性结直肠癌的发生与PIK3CA上调表达存在显著相关性。高表达PIK3CA的结直肠癌细胞通过抑制细胞凋亡，维持肿瘤细胞的生存优势。在瑞戈非尼耐药的发生过程中，KPNB1的上调表达可能发挥着重要作用。
研究目的：
本研究旨在探究PI3K各亚单位在转移性结直肠癌的变化分析，PIK3CA突变在转移性结直肠癌中的作用以及对瑞戈非尼产生耐药的分子机制,为转移性结直肠癌的治疗提供循证依据，并为新药筛选提供新的治疗方向。
研究方法：
1、收集CRC患者的100个肿瘤样品组织，根据其患者临床分期，分为早期肿瘤和中晚期肿瘤，运用TCGA数据分析比较不同阶段PI3K各亚单位的mRNA表达水平，查找随临床进展水平显著升高的基因。同时对早期结直肠癌与转移性结直肠癌组织进行免疫组化分析,结合随访结果,对两组结直肠癌的各临床病理特征因素进行单因素分析,探讨该PI3K亚单位对结直肠癌患者的影响。2、培养HCT-116、SW480细胞株，建立该PI3K亚单位高表达细胞系,用CCK-8试验绘制瑞戈非尼治疗后HCT116细胞系的生长曲线,流式观察分析比较瑞戈非尼处理转染后的细胞与对照组细胞凋亡情况,并用Western blot、实时定量PCR予以验证；再次运用TCGA数据分析伴随该PI3K亚单位高表达的CRC患者密切相关的细胞凋亡抑制基因，免疫组化等方法检测相关抑制基因该PI3K亚单位的表达情况，以明确该PI3K亚单位与瑞戈非尼耐药的关系及分子作用机制。
研究结果：
1、TCGA数据库分析提示，PIK3CA在转移性结直肠癌中mRNA水平显著升高；
2、PIK3CA免疫组化提示PIK3CA在转移性结直肠癌中的表达水平明显高于早期结直肠癌组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
3、对实验组细胞与对照组细胞行RT-PCR检测，结果发现HCT116、SW480细胞PIK3CA mRNA表达量均高于对照未转染组（P＜0.05）。Western blotting检测蛋白表达结果发现转染组PIK3CA蛋白表达明显高于对照组。
4、流式细胞检测结果显示PIK3CA低表达的结直肠癌细胞在同浓度的瑞戈非尼药物的作用下，较PIK3CA高表达的细胞呈现出对肿瘤细胞更加明显的早期调亡诱导效应。
5、瑞戈非尼处理PIK3CA高表达的结直肠癌细胞，RT-PCR检测结果显示PIM2、IAK、TACC1及IFR的上调与结直肠癌耐药相关性不明显，KPNB1与瑞戈非尼耐药存在显著相关性（P＜0.05）。
6、KPNB1免疫组化检测结果提示KPNB1在PIK3CA高表达的结直肠癌中的表达水平明显高于PIK3CA低表达的结直肠癌组织，差异具有统计学意义（P＜0.05），可能是介导瑞戈非尼耐药的关键分子之一。
研究结论：
转移性结直肠癌的发生与PIK3CA上调表达存在显著相关性。高表达PIK3CA的结直肠癌细胞通过抑制细胞凋亡，维持肿瘤细胞的生存优势。在瑞戈非尼耐药的发生过程中，KPNB1的上调表达可能发挥着重要作用。