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目的:脓毒症(sepsis)是临床上严重感染患者常见的致命性并发症,发病率和病死率一直居高不下,迄今为止除了抗感染和抗休克等对症治疗措施以外,仍然没有理想的特效治疗手段。因此,临床上对于抗脓毒症药物存在巨大需求。现有研究已经证实,脓毒症是由于侵入人体的病原体释放的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)被体内相应的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)结合与识别,引发全身性的过度炎症反应。统计显示,在发生脓毒症的患者体内,90%以上的病原体为细菌,而细菌产生的PAMPs中毒性强、数量多、分布广的PAMPs主要是内毒素/脂多糖(endotoxin/lipopolysaccharide,LPS),细菌基因组DNA(细菌非甲基化Cp G DNA)以及肽聚糖(peptidoglycan,PGN)等。因此,以细菌产生的主要PAMPs为靶标拮抗脓毒症是一条可行的治疗策略。在这一策略指导下,我们利用生物传感器定向垂钓技术,从中药中发现了一个具有同时拮抗LPS和Cp G DNA活性的先导化合物苦柯胺B(kukoamine B,KB)。KB能够结合并中和LPS和Cp G DNA,阻断它们与各自受体的结合,从而抑制炎症反应,改善脓毒症模型动物各项生理指标,提高生存率。尽管KB的药理活性与作用机制已经得到证实,但其为何能同时作用于两种靶标尚不清楚。本课题拟通过分子相互作用的动力学和热力学分析以及分子对接等手段揭示KB与LPS和Cp G DNA的结合模式,阐明其结合作用机理,据此设计一系列衍生物,并进行生物学活性评价,以期发现具有更强活性的化合物,为开发更好的抗脓毒症药物奠定基础。方法:1.采用共振镜生物传感器,将LPS的活性中心lipid A包被于芯片表面,检测KB与lipid A的结合作用;采用双偏振极化干涉仪(dual polarization interferometry,DPI),将Cp G DNA包被于芯片表面,检测KB与Cp G DNA的结合作用;采用等温滴定量热仪(isothermal titration calorimetry,ITC),分别检测KB与LPS和Cp G DNA的结合作用;采用分子对接,分别分析KB与LPS和Cp G DNA的结合模式。从分子结合动力学、热力学以及计算机模拟等不同角度分析KB与LPS和Cp G DNA的结合作用;2.根据KB与LPS和Cp G DNA相互作用的结构特征和模式,设计一系列KB衍生物,并采用基于分子对接和药效团搜索的方法进行首轮虚拟筛选,从中遴选出活性预测较好的化合物进行合成;3.通过共振镜生物传感器检测KB衍生物与LPS和Cp G DNA的结合作用;动态浊度法鲎试剂检测KB衍生物(0.1和1μM)对LPS(5 ng/ml)引发鲎试剂凝集反应的抑制作用;酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测KB衍生物(0.3和1μM)对LPS(100 ng/ml)和Cp G DNA(10μg/ml)诱导RAW264.7细胞释放细胞因子TNF-α的抑制作用。通过生物活性评价对合成的KB衍生物进行进一步的筛选,从中选择活性最好的化合物进行体内外活性评价;4.对最终筛选出的KB衍生物H1,采用ELISA检测H1(0.01~1μM)对LPS(100 ng/ml)和Cp G DNA(10μg/ml)诱导RAW264.7细胞释放细胞因子TNF-α的抑制作用;盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)建立脓毒症小鼠模型,采用尾静脉给药方式,观察H1(1~10μg/kg)对模型小鼠的保护作用。结果:1.阐明了KB与LPS和Cp G DNA的结合模式,KB主要以氢键和疏水作用与LPS和Cp G DNA结合。KB与LPS结合的主要位点位于LPS的磷酸官能团,同时也与其脂肪酸和Kdo侧链有结合作用;KB与Cp G DNA结合的主要部位在于其GACGTT这一核心序列;2.设计了9个系列共计31个KB衍生物,虚拟筛选预测衍生物E1和H1活性优于KB,对此我们进行了化学合成。此外,我们还选择了预测活性与KB相当的A1和活性显著下降的SPM作为阴性对照进行了测试;3.体外生物传感器、鲎试剂检测以及ELISA检测结果从不同角度显示,H1活性最好。在RAW264.7细胞模型上,对LPS和Cp G DNA诱导释放TNF-α的抑制作用分别比KB提高了1倍和5倍。在CLP模型动物上,H1显著提高动物存活率,具有统计学差异,并呈剂量-效应依赖关系。结论:通过对KB与LPS和Cp G DNA结合作用的研究,阐明了KB双靶标作用的结构特征与基础。KB主要通过氢键和疏水作用与LPS和Cp G DNA的关键位点结合,从而阻断它们与各自受体的作用。在此基础上设计、筛选出了具有更好活性的衍生物H1。该研究对全面阐释KB的作用机制具有重要意义,也为进一步深入进行结构优化与合理药物设计,发现更好的抗脓毒症药物奠定了基础。