急性肺损伤(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是临床上危重病人常见的严重的并发症和死亡原因,其死亡率高达40%,治疗效果较差。临床上主要表现为非心源性肺水肿、难治性低氧血症、肺动脉高压而体循环低血压。肺液体屏障的损伤是肺水肿发生的病理基础,肺泡对水的廓清能力下降导致肺水肿的发生。肺泡上皮对钠及氯化物的主动转运决定了肺泡液体清除的速度。钠的主动转运主要是由钠通道及钠钾ATP酶共同完成。研究发现ENa C是肺水清除的限速酶。另外有研究证实水通道,囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)等也参与了肺泡液体的清除。跨膜蛋白TMEM16A,也叫anoctamin 1(ANO1),是2008年证实的TMEM家族中与细胞分泌相关的新型成员。已有研究证明在气道上皮高表达,而肺泡上皮则表达较低。TMEM16A作为一种氯离子通道,通过ATP酶的释放及与P2Y受体结合调节细胞容积,同时在体实验也证实TMEM16A基因敲除小鼠,上皮细胞的容积调节能力降低。但是其在肺损伤肺水清除中的作用尚无报道。PI3K/Akt是细胞内重要的信号通路之一,参与调节多种生物学过程。活化的Akt可以进一步激活或抑制下游一系列的底物,进而调控生物体若干基因转录,影响细胞周期、物质代谢、细胞迁移以及细胞增殖与凋亡等多种生物学过程。通过双链RNA诱导的基因沉默,称为RNA干扰(RNA interference,RNAi),能特异、高效沉默某特定基因。一般通过病毒载体或表达质粒获得RNAi的稳定转染。其中慢病毒载体具有稳定感染细胞的能力,已经成为国际上通用的转染系统,广泛用于实验室研究。我们使用慢病毒介导的si RNA技术,构建小鼠TMEM16A-sh RNA慢病毒载体,并体外验证其干扰效率,局部沉默小鼠肺部TMEM16A基因的表达,探讨TMEM16A在正常小鼠及LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺水清除中的作用。并在细胞水平研究是否PI3K/Akt信号转导通路调控TMEM16A水平的表达。第一部分靶向TMEM16A小分子干扰RNA慢病毒载体的构建与鉴定目的:以小分子干扰RNA技术构建小鼠TMEM16A-sh RNA(TMEM16A干扰病毒)慢病毒载体,并在小鼠肺腺癌细胞(LA795)中行体外干扰效率鉴定。方法:1细胞免疫爬片SP(streptavidin-perosidase)法验证TMEM16A在LA795细胞的表达。2实时定量(Real-Time)PCR验证TMEM16A在LA795细胞表达丰度。3为保证沉默效果,设计4个TMEM16A小分子干扰RNA(si RNA)序列,慢病毒载体的制备,获得带有TMEM16A-sh RNA慢病毒载体。4行感染预实验,根据病毒转染效率对转染试剂配方和病毒的MOI值进行筛选。5正式实验细胞分为6组:未感染任何病毒的细胞组(空白对照组)(Control;Con);阴性对照病毒感染的细胞组(阴性病毒感染组)(Negative Control,NC);1号靶点沉默组(KD1);2号靶点沉默组(KD2);3号靶点沉默组(KD3);4号靶点沉默组(KD4)。72小时后收集细胞,提取m RNA,行Real-Time PCR验证找出沉默效率高的靶序列。6根据PCR结果,选择最有效的序列,再行Western blots进一步验证沉默效果。结果:1 LA795细胞膜上存在TMEM16A的表达,而且丰度较高,适合于做敲减验证。2 LA795细胞在5ug/ml的Eni.S+polybrene条件下容易被感染,MOI为20。3 Real-Time PCR结果显示KD1、KD2、KD3、KD4组TMEM16A基因的m RNA均较NC组降低(p<0.05),其中以KD1的沉默效果最好。4 Western blots进一步显示体外细胞实验KD1的沉降效率约81.35%。结论:TMEM16A蛋白表达丰度较高,适合于做敲减验证。成功构建小鼠TMEM16A-sh RNA慢病毒载体,其可有效抑制TMEM16A蛋白的表达。第二部分Lenti-TMEM16A-sh RNA对正常及急性肺损伤小鼠肺水清除、肺组织凋亡的影响目的:通过Lenti-TMEM16A-sh RNA(TMEM16A干扰病毒)气管内注射的方法,局部沉默TMEM16A蛋白的表达,探讨TMEM16A在正常及急性肺损伤小鼠肺水清除、肺组织凋亡中的作用。方法:1慢病毒肺组织转染沉默效果验证:C57BL/6小鼠气管内注入慢病毒阴性对照病毒(Lenti-Neg-sh RNA),2周后取材,测定Lenti-Neg-sh RNA对肺组织蛋白渗漏及病理的影响,明确慢病毒本身会不会对肺组织造成影响。激光共聚焦显微镜观察报告基因GFP的绿色荧光表达。气管内注入Lenti-TMEM16A-sh RNA提取蛋白Western-blot验证Lenti-Neg-sh RNA转染沉默效果。2 C57BL/6小鼠分为3组,分别为control、Lenti-Neg-sh RNA、Lenti-TMEM16A-sh RNA组。测定AFC的变化,Western-blot检测AFC相关蛋白α-ENa C和CFTR的表达变化,凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的变化。3复制LPS诱导的小鼠ALI模型,激光共聚焦显微镜观察control和ALI两组TMEM16A与ZO-1表达的变化。4C57BL/6小鼠分为4组,Control、inhibitor-TMEM16A、ALI、ALI+inhibitor-TMEM16A组,给予TMEM16A抑制剂各组AFC的变化,并Western-blot检测ALI时α-ENa C和CFTR的表达变化。结果:1慢病毒肺组织转染沉默效果验证:(1)气管内注入Lenti-Neg-sh RNA后支气管肺泡灌洗液的蛋白含量无增加;光镜下肺组织结构正常,未造成病理损伤,激光共聚焦显微镜下可见GFP表达,以支气管气道明显,肺泡腔散在表达。(2)气管内注入Lenti-TMEM16A-sh RNA后,Western-blot结果显示TMEM16A表达水平降低,达到在肺部部分沉默TMEM16A的目的。2正常小鼠TMEM16A表达水平降低后AFC无明显降低(P>0.05),α-ENa C和CFTR的表达也无明显变化(P>0.05)。TMEM16A表达水平降低后Bcl-2含量减少(P<0.05),而Bax含量升高(P<0.05)。3激光共聚焦显微镜显示ALI组TMEM16A表达明显增高,且紧密连接蛋白ZO-1线状结构损伤,肺组织结构损伤。4 ALI组AFC较control组明显下降(P<0.05),ALI+inhibitor-TMEM16A组AFC较ALI组降低(P<0.05),但Control组和inhibitor-TMEM16A组AFC无差异(P>0.05)。Westem-blot结果显示ALI组α-ENa C表达较control组明显下降(P<0.05),而ALI组CFTR表达较control组升高(P<0.05)。结论:慢病毒本身比较安全,在本次试验中未增加肺组织的蛋白渗漏及病理损伤,并能有效转染支气管上皮细胞并在局部表达,但在肺泡上皮转染率较低;在正常小鼠,TMEM16A可能不是主要参与肺水清除的离子通道;TMEM16A可能有抗凋亡的作用,TMEM16A表达降低时,促凋亡蛋白Bax表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少。ALI时,TMEM16A表达增高,给予TMEM16A抑制剂后,AFC下降更明显,推测其在ALI时可能为一种保护性蛋白,提高AFC。ALI时,AFC下降除了和α-ENa C表达减少相关外,和肺组织紧密连接破坏,细胞旁路受损也起了一定作用。第三部分PI3K/Akt通路对LPS诱导的细胞损伤中TMEM16A表达调控目的:探讨PI3K/Akt信号转导通路是否调控LPS诱导的细胞损伤过程中TMEM16A水平的表达。方法:1 LPS刺激LA795细胞,刺激后0,6,12,18,24,48小时后收集细胞,行western-blot实验,测定TMEM16A、t-Akt、p-Akt蛋白表达。不同浓度的LY294002(特异性PI3K抑制剂)对TMEM16A、t-Akt、p-Akt的影响。根据LY294002的浓度分组如下:LPS刺激组、LPS刺激+5umol/L LY294002干预组、LPS刺激+20μmol/L LY294002干预组、LPS刺激+40umol/L LY294002干预组。24小时后,收行Western blot检测TMEM16A、t-Akt、p-Akt蛋白表达。2 LY294002干预对TMEM16A、Akt和p-Akt蛋白表达的影响。实验分组如下:control组、control组+40umol/L LY294002干预组、LPS刺激组、LPS刺激+40umol/L LY294002干预组。24小时后,收集细胞行Western blot检测TMEM16A、t-Akt、p-Akt蛋白表达。3激光共聚焦显微镜免疫荧光观察LA795细胞上4组(control组、control组+40umol/L LY294002干预组、LPS刺激组、LPS刺激+40μmol/L LY294002干预组TMEM16A和α-tubulin蛋白的免疫荧光的变化。结果:1 LPS刺激后6小时,TMEM16A开始升高,24小时TMEM16A的表达量达高峰。随LPS刺激时间延长,p-Akt表达逐渐增强,18h达高峰(P<0.05)。t-akt的表达则随LPS刺激时间的延长没有明显变化(P>0.05)。2 Western-blot结果显示随着LY294002浓度的增加,p-Akt表达逐渐减弱。当LY294002的浓度达到40umol/L时,p-Akt的表达明显减弱。(P<0.05)。LY294002对t-akt没有明显的抑制作用,各组间无统计学意义(P>0.05)。随着LY294002浓度的增加,TMEM16A表达水平逐渐增加。当LY294002的浓度达到40umol/L时,TMEM16A表达增加明显(P<0.05)。3 Western-blot结果显示,40umol/L LY294002对正常对照组的TMEM16A和p-Akt无明显影响(P>0.05),但是对LPS刺激组的p-Akt有明显的抑制,且TMEM16A经LY294002作用后,表达明显增高(P<0.05)。4免疫荧光进一步证实TMEM16A为跨膜蛋白,表达在细胞膜上;而α-tubulin为微管结构,主要分布在胞浆,形成稳定的细胞骨架。TMEM16A的红色荧光在LPS刺激+40umol/L LY294002干预组明显增多。这与Western-blot结果一致。结论:LPS诱导下TMEM16A蛋白表达水平动态改变,提示TMEM16A参与了细胞的损伤过程。LPS以时间依赖的方式刺激LA795细胞内p-Akt表达增强,特异性PI3K/Akt通路阻断剂LY294002以浓度依赖的方式抑制p-Akt生成,并提高TMEM16A的表达水平。PI3K/Akt通路在LPS诱导的细胞损伤过程中对TMEM16A的表达有一定调控作用。