紫杉醇是一种广泛使用的癌症化疗药物,而巴卡亭III是紫杉醇生物合成途径中的重要前体,其生产成本的下降有望降低紫杉醇的价格和满足其市场需求。针对生物合成途径中生成巴卡亭III的反应的天然底物乙酰辅酶A价格昂贵的问题,本研究致力于寻找廉价的非天然酰基供体替代它。由于乙酸乙烯酯(vinyl acetate,VA)是常用的活化酰基供体且具有乙酰基,相比于天然底物乙酰辅酶A,它价格相当低廉。此外,利用VA作为酰基供体的反应生成物是乙烯醇,乙烯醇不稳定,可以立即互变异构成可挥发的乙醛,所以驱使反应不断往正方向进行,其不可逆性导致了它具有酰化快速的优势。本文对VA可否替代乙酰辅酶A作为新型酰基供体与10-去乙酰基巴卡丁III(10-deacetylbaccatin III,10-DAB)在10-去乙酰巴卡亭III 10-β-O-乙酰转移酶(10-deacetylbaccatin III-10-β-O-acetyl transferase,DABT)催化下生成巴卡亭III进行了探索,同时对DBAT进行了半理性改造,以提高其催化新底物的效率。本文的主要研究结果如下:(1)构建了DBAT酶的表达载体。以pET-32a质粒为框架,SacⅠ、BamHⅠ为酶切位点,dbat为目标基因,构建了载体pET32a-dbat载体用于外源蛋白表达,结果表明该载体可用于外源DBAT表达。(2)确定了新型酰基供体VA可取代天然酰基供体乙酰辅酶A。用VA替换掉乙酰辅酶A作为酰基供体的体外催化反应中,推测DBAT的His-162作为催化碱基,首先将酰基受体10-DAB的C10羟基去质子化,从而对VA的羰基碳进行亲核攻击,形成四面体中间体,随后该中间体重新排列产生紫杉醇前体巴卡亭III和副产物乙烯醇,乙烯醇立即互变异构成乙醛,从体系中挥发出去。(3)构建了DBAT的3D模型。由于DBAT的晶体结构数据尚未有报道,本研究利用同源建模对DBAT的三维结构进行预测,构建的模型的合理性经PROCHECK评价,结果表明模型合理。(4)为了提高DBAT对新型酰基供体反应体系的催化效率,本研究采用了理性设计与定向进化相结合的半理性设计策略对DBAT进行了改造。基于增强底物与酶分子之间的氢键相互作用可以稳定两者间的电荷,同时可以增强底物分子的定向作用,从而使得底物与酶分子快速结合同时稳定反应的过渡态的原理,对DBAT的底物结合口袋中的所有氨基酸(10个)进行了虚拟饱和突变(将它们全部突变为除自身外的19种氨基酸),产生了190个单突变体。对所得的DBAT突变体进行分析,结果显示只有I43S、I43T、D390H和D390R与VA之间引入了额外的氢键。(5)研究利用PCR定点突变技术构建了上述4个单突变体,并测定了它们的动力学参数,结果显示对于DBAT体外催化10-DAB与VA生成巴卡亭III的酶促反应,I43S的催化效率比野生型高了2.12倍,而I43T比野生型高2.09倍,D390R高2.29倍。结合单体变体的正向效应构建了双突变体I43S/D390R,与野生型DBAT相比,I43S/D390R对以10-DAB和VA为底物的反应催化效率提高了约3.30倍,同时比野生型DBAT对以10-DAB和乙酰辅酶A为底物的反应催化效率高约2.99倍。本研究可为紫杉醇的生产提供经济和环境友好的方法,并为探索新型酰基供体改造天然产物途径提供参考。