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一、目的Th1向Th2偏移在肿瘤免疫耐受中起重要作用，提高Th1细胞数量，将有利于肿瘤患者失衡的Th1／Th2比例恢复，从而有利于细胞免疫功能的增强。T-bet是Th1细胞的特异性转录因子，可调控Th1细胞分化。本课题通过研究基因修饰的肿瘤疫苗的抗肿瘤作用，探讨T-bet基因如何调控Th1优势分化及提高抗瘤效能，从而为恶性肿瘤的主动免疫治疗提供更高效、特异的免疫活性细胞，为肿瘤的防治提供新的手段。二、方法1．根据Genbank中人T-bet基因的全长cDNA序列，设计合成一对附加BglⅡ和SalⅠ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物。分离人外周血单个核细胞，提取RNA，用RT-PCR方法将T-bet的编码序列cDNA扩增，装入pMD18-T载体并测序。BglⅡ+SalⅠ双酶切质粒pMD18-T-bet，经琼脂糖电泳切胶回收T-bet片段，将T-bet插入载体pEGFP-C1构建成重组真核表达载体pEGFP-C1-T-bet。用双酶切和PCR方法对插入片段进行分析和验证。2．运用脂质体法将pEGFP-C1-T-bet转染人肝癌细胞HepG2，转染24h后，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，G418加压筛选出表达t-bet基因的阳性克隆细胞，建立稳定表达T-bet的人肝癌细胞株HepG2-T-bet。分别用RT-PCR和Western Blot方法检测HepG2-T-bet中T-bet mRNA和蛋白的表达。将HepG2-T-bet细胞用丝裂霉素C(mitomycin C，MMC)处理后制成瘤苗TCV-T-bet，MTT法检测MMC灭活后HepG2-T-bet有无增殖活性，RT-PCR检测MMC处理前后6h、24h和48h TCV-T-bet中T-bet表达的变化。3．体外培养肝癌患者的外周血淋巴细胞(pcdpberal blood lymphocyte，PBL)，ELISA检测瘤苗刺激PBL后上清中细胞因子IFN-γ和IL-4的浓度，流式细胞术分析PBL表型变化，采用MTT法测定瘤苗体外诱导淋巴细胞的杀伤活性。三、结果1．RT-PCR产物经琼脂糖电泳结果显示在预期位置有相对分子质量为1608bp的特异性扩增带。测序结果证实，T-bet的编码序列和Genbank中T-bet mRNA序列相同。双酶切和PCR结果证实插入片段序列正确。2．转染了pEGFP-C1-T-bet载体的靶细胞HepG2中，荧光显微镜下可见其表达绿色荧光蛋白，G418(640mg／L)作用14d后，筛选出了稳定表达T-bet基因的阳性克隆细胞HepG2-T-bet，RT-PCR方法检测到目的基因T-bet的一个202bp大小的cDNA扩增产物。Western Blot的结果也证实了T-bet蛋白的表达，约53kd。MTT法证实MMC灭活后HepG2-T-bet已无增殖活性，并在MMC处理前后6h、24h和48h RT-PCR检测到TCV-T-bet中T-bet基因的稳定表达。3．(1)淋巴细胞+TCV-T-bet共培养上清中IFN-γ的含量，24h、48h、72h均显著高于淋巴细胞+培养液组和淋巴细胞+TCV-HepG2组的IFN-γ的含量(p＜0.01)；同时该组中IL-4的含量，与其他两组的IL-4的含量相比，无显著差别(p＞0.05)。(2)淋巴细胞+TCV-T-bet组Th1细胞因子IFN-γ的分泌显著高于淋巴细胞+TCV-HepG2组或淋巴细胞+培养液组，差异有统计学意义(p＜0.05)；同时该组Th2细胞因子IL-4的分泌显著低于其他两组，差异有统计学意义(p＜0.05)。(3)经TCV-HepG2及TCV-T-bet体外诱导后效应细胞对人肝癌细胞HepG2的杀伤率分别为(14.1±0.17)％及(30.7±0.3)％，而空白对照组杀伤率为(7.4±0.5)％，方差分析表明，三组之间差异有显著意义(p＜0.05)。四、结论成功扩增出人T-bet基因，构建人T-bet的真核表达载体pEGFP-C1-T-bet，建立稳定表达T-bet的人肝癌细胞株HepG2-T-bet，制备表达T-bet基因的人肝癌细胞瘤苗TCV-T-bet，此瘤苗在体外能够诱导有效的抗肿瘤免疫反应。为研究T-bet基因对免疫细胞的调节和肿瘤基因治疗奠定了基础。