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一、研究背景与研究目的乳腺癌是发生于乳腺小叶或导管上皮的恶性肿瘤，是女性常见的恶性肿瘤之一，发病率占各种恶性肿瘤的710%。因此，世界众多学者对乳腺癌发生、发展以及治疗和预后做了大量的研究。众所周知，乳腺癌发生的主要原因是乳腺上皮细胞或乳腺导管上皮细胞的细胞周期失调后导致的细胞无限增殖。因此明确乳腺癌前体细胞和癌细胞的细胞周期运行和调节的差异对于乳腺癌的治疗具有重要意义。抑制细胞增殖促使细胞凋亡是当今治疗癌症的主要思想。凋亡的调节和执行异常可导致肿瘤的发生，进展、以及治疗预后等。因此我们观察了长春西汀对乳腺癌细胞周期和凋亡的影响。长春西汀（vinpocetine）为脑血管扩张药，能够抑制磷酸二酯酶活性，增加血管平滑肌松弛信使cGMP的活性，抑制Na+离子通道和Ca2+离子通道。已有文献报道长春西汀能抑制PDE的活性，另有文献报道使用PDE抑制剂IC86340敲除PDE后，血管平滑肌细胞增殖受到抑制。我们观察了乳腺癌细胞的影响，发现长春西汀能抑制乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡。因此在国家自然科学基金（NO.30900530）的资助下，本课题开展了该药对乳腺癌细胞抑制增殖、诱导凋亡的实验及其相关机制研究。二、方法与结果第一部分长春西汀抑制乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡方法：1．长春西汀对乳腺癌细胞周期的影响在本实验中，我们用CCK-8法观察了长春西汀对乳腺癌细胞增殖的影响，用PI染核流式细胞仪观察了长春西汀对乳腺癌细胞周期的影响，并用WB检测了长春西汀对周期相关蛋白Cyclin D、Cyclin E、P16INK4a的表达变化。结果：1).CCK-8法结果表明长春西汀浓度依赖性抑制乳腺癌细胞增殖。2).PI染核流式细胞仪分析发现长春西汀浓度依赖性使MDA-MB-231细胞的细胞周期阻滞在G1期，同时出现了凋亡。并进一步用MCF-7细胞验证了以上结果。3).WB结果显示长春西汀处理乳腺癌24h后， Cyclin D、Cyclin E蛋白的表达下调， P16INK4a蛋白表达上调。2．长春西汀对乳腺癌细胞凋亡的影响在本实验中，我们通过Annexin V和PI双染、Hoechst33258染核、JC-1探针测线粒体膜电位的方法观察长春西汀对乳腺癌细胞凋亡的影响，并用WB进一步检测了Caspase的活性、Bcl-2和Bax的表达变化以及Cyt. C的变化。结果如下：1).通过Annexin V和PI双染结果显示长春西汀能诱导MDA-MB-231细胞凋亡。同时，我们检测了30μM长春西汀处理后ZR-75-1细胞和MCF-7细胞，结果同样显示凋亡增加。2).通过Hoechst33258染色观察细胞凋亡的形态学变化。我们发现Hoechst33258染色后出现了细胞皱缩、核染色质浓缩和凋亡小体。3).JC-1探针测线粒体膜电位显示，长春西汀能使乳腺癌细胞线粒体降低。Western Blot结果显示长春西汀抑制了Bcl-2的表达，并且使线粒体Bax发生转位，诱使线粒体cytochrome c释放至胞浆且促使caspase-3,8,9的活性增加。3.长春西汀抑制乳腺癌细胞迁移在本实验中，我们用Transwell小室实验（transwell migration assay）观察（15,30,60μM）长春西汀对乳腺癌细胞迁移的影响。结果表明长春西汀能浓度依赖性的抑制乳腺癌细胞迁移。4.长春西汀对Akt/STAT3/MAPKs信号的影响为进一步研究长春西汀阻滞细胞周期诱导细胞凋亡和抑制细胞迁移的分子机制，我们通过Western Blot检测了长春西汀对Akt/STAT3/MAPKs信号通路的影响。我们发现长春西汀能明显抑制p-Akt、p-Stat3的表达，但对p-ERK、p-JNK、p-p38的表达没有影响，这给我们提示长春西汀可能通过抑制抑制p-Akt、p-Stat3的表达来阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡和抑制细胞迁移的，但不影响MAPkinases。小结：1).长春西汀可能通过下调CyclinD、CyclinE，上调P16蛋白表达使乳腺癌细胞周期阻滞在G1期，抑制细胞增殖。2).长春西汀处理乳腺癌细胞能下调Bcl-2的表达，促进cytochrome c由线粒体释放至胞浆，降低乳腺癌细胞线粒体的膜电位，最终激活caspase-3,8,9这提示长春西汀可能激活了细胞线粒体凋亡途径和死亡配体途径。3).长春西汀能浓度依赖性的抑制乳腺癌细胞迁移。4).长春西汀可能通过抑制抑制Akt/STAT3信号通路来阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡和抑制细胞迁移。第二部分长春西汀对乳腺癌裸鼠移植瘤的瘤体的影响方法：为进一步观察长春西汀对乳腺癌细胞的影响，我们采用了乳腺癌裸鼠移植瘤模型，观察长春西汀对瘤体增殖的影响。我们用游标卡尺每三天测量一次瘤体体积，并用电子天平测量裸鼠体重的差异；进一步取瘤体组织切片，TUNEL染色，荧光显微镜下观察长春西汀对瘤体组织凋亡的影响；并用免疫荧光法检测瘤体组织中p-Akt、p-Stat3表达的变化。结果:1).长春西汀能阻滞乳腺癌瘤体的生长。2).取裸鼠肿瘤切片，，荧光显微镜下观察到长春西汀能促进肿瘤细胞凋亡。3).取裸鼠肿瘤切片，免疫荧光检测观察到长春西汀能降低p-STAT3/p-Akt的表达。小结：1).长春西汀抑制乳腺癌瘤体增长并诱导乳腺癌组织的凋亡。2).长春西汀能降低瘤体组织中p-STAT3、p-Akt的表达三、结论：1.长春西汀可抑制乳腺癌细胞增殖、使细胞停滞在G1期。2.长春西汀诱导乳腺癌细胞凋亡，抑制乳腺癌细胞迁移。3.长春西汀可抑制乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长并诱导移植瘤中肿瘤细胞凋亡。4.长春西汀可能通过调控Akt/STAT3而非MAPK介导的信号途径参与调控乳腺癌细胞增殖、凋亡和迁移。