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稻瘟病是影响水稻安全生产的三大病害之一,而稻瘟菌是诱发稻瘟病的重要真菌病原物。同时,稻瘟菌基因组序列已知、遗传转化体系完备和致病鉴定体系成熟,使得稻瘟菌成为了丝状真菌研究的模式真菌。鉴于水稻生产的重要意义及水稻分子生物学研究的成熟系统,稻瘟菌和水稻互作系统同时也是研究病原物与寄主相互作用的模式系统。因此,关于稻瘟菌分子生物学及稻瘟菌与水稻互作的研究不仅具有重要理论意义,还具有更重要的实践价值。本研究在对稻瘟菌菌株CH63中已克隆无毒基因进行测序分析,确定不同无毒基因的序列差异的基础上,利用稻瘟菌公共序列Magnaporthe oryzae Release 5和Magnaporthe oryzae Assembly 6分别设计大量SSR标记对CH63菌株中的4个由一对基因控制的新无毒基因位点的物理位置进行了解析。同时,本研究还对稻瘟菌不同基因组序列版本的一些差异进行了分析,以期对今后的研究工作提供一些参考。以下就为本研究所进行的相关实验描述及目前取得的实验进展：1.根据已经克隆的17个无毒基因以及相关的蛋白基因序列,测定基因在亲本之间序列差异,通过设计已克隆无毒基因的扩增引物,对菌株CH63, TH16和Guy 11中的无毒基因进行扩增,并对序列进行分析。部分基因在不同菌株中的测序结果存在差异,如PWL2在稻瘟菌株CH63,TH16和Guy 11序列的特定区域有缺失的现象,三种菌株之间无毒基因的序列存在差异。除Avrl-CO39基因组未能扩增出相应目的条带外,其他基因的扩增片段测序结果比对均无差异。2.基于Mganaporthe oryzae Release 5基因组序列,结合使用SSRIT工具、SSRHunter软件及Primer3,共发展SSR标记106个。通过亲本间多态性的筛选,获得18个在CH63和TH16间表现多态的分子标记。利用多态性标记对F,群体中单孢分离菌株进行基因型分析,并结合标记在Magnaporthe oryzae Release 5基因组上的物理位置,最终成功完成了4个无毒基因中3个物理位置的确定。其中,Avr-Zh201位于标记SSR-5.195-79/80与端粒的约628 kb区间内。Avr-C105TTP1的物理位置锁定的标记SSR-5.17717/18与pyms409-410之间892 kb的距离上。交换事件分别为17和24。无毒基因Avr-Zh156被定位在了标记pyms271-272与SSR-5.125-17/18间175 kb的物理距离内。3.鉴于利用Magnaporthe oryzae Release 5基因组序列未能完成所有无毒基因物理位置的确定,以及新版本基因组序列Magnaportheoryzae Assembly 6的公布,我们又利用新版本数据库,结合SSR位点搜索工具及引物设计软件新开发了379对SSR标记,同时还利用无毒基因AvrPiz-t定位过程中采用的17个PATE标记进行亲本间标记的多态性筛选。通过筛选,获得了37对在亲本间表现多态的SSR标记,而17个PATE标记中只有1个标记P.21.1698.1在CH63和TH16间表现多态。利用这38个多态性标记,对F1群体的84个单孢菌株都进行了基因型分析,结合标记物理位置信息,成功完成了4个无毒基因的物理区域定位。Avr2-K59是唯一一个被定位在两个SSR标记之间的无毒基因。SSR-6.9-6970和SSR-6.27-8788分别位于无毒基因Avr2-K59的两端,可能的物理距离约为165 kb。Avr-Zh201和Avr-Zh156都定位在了端粒区域,分别于SSR-6.29-4142和SSR-6.23-4344连锁,这两个无毒基因所在物理区间分别为109和808 kb。无毒基因Avr-C105TTP1的物理图谱显示它与SSR-6.12-103104连锁,横跨约616 kb的物理距离。4.在定位新无毒基因的过程中我们发现不同版本稻瘟菌基因组存在较大差异,因此我们通过比较不同版本稻瘟菌基因组序列,功能基因在不同基因组版本中的位置及长度, SSR位点分析的分布,引物在不同版本基因组中的位置及连锁标记的位置等对不同基因组版本之间的差异进行了分析。不同版本的基因组在各条染色体上的长度各不相同,基因数也有所区别。功能基因在不同基因组版本中的位置也各不相同,基因组所含SSR核苷酸重复类型数量有差异,引物在不同版本基因组中的位置大不相同,Avr-Pizt连锁标记的位置在不同稻瘟菌基因组中也发生了变化。稻瘟菌基因组的四个版本,CHr7的BAC序列之间有一定差异。由于稻瘟菌不同菌株间序列的显著差异,尽管分别利用Magnaporthe oryzae Release 5和Magnaporthe oryzae Assembly 6数据库对无毒基因的物理位置进行了研究,但结果表明,不同版本数据库间的物理序列存在极大差异。因此,进一步的研究需要构建CH63的BAC文库,通过已有连锁标记调取定位区间,再进行染色体步移来完成。