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木聚糖酶抑制蛋白抑制木聚糖酶催化水解木聚糖,给木聚糖酶在工业生产上的应用带来了不便,另外它在植物防御致病菌以及害虫侵害的过程中也担任重要角色。木聚糖抑制蛋白中的XIP型抑制蛋白与几丁质酶在进化上存在一定的关系,并且几丁质酶家族中有些不活跃的几丁质酶具有木聚糖酶抑制活性。本实验根据酶-抑制蛋白的相互作用,采用固定化木聚糖酶亲和纯化的方法从小麦品种小偃22子粒的粗蛋白浸提液中亲和纯化出木聚糖酶抑制蛋白,并从小偃22总DNA中克隆得到一段基因,使其在大肠杆菌和毕赤酵母表达系统中进行异源表达,并对异源表达产物进行分析,结果如下:(1)3%戊二醛交联16h,固定化酶小球的回收率37.8%,固定化酶亲和吸附48h,固定化木聚糖酶亲和吸附木聚糖酶抑制蛋白的吸附率为47.88%。亲和纯化得到的蛋白溶液其木聚糖酶抑制蛋白的抑制率为60.65%,最适抑制温度为30℃,最适抑制pH为7.0。(2)根据实验组前期得到的野生型木聚糖抑制蛋白的N端序列SVSSVVS,进行序列比对,设计引物,提取小麦总DNA,PCR扩增出大小合适的核酸片断,TA克隆,提取质粒测序。通过序列对比,从克隆得到的众多基因序列中选取出现概率较高的与NCBI上的AY973230.1基因序列完全一致且与几丁质酶基因有很高同源性的基因作为研究对象。(3)日的基因在大肠杆菌中28℃诱导5h收集菌体超声破碎,通过SDS-PAGE检测,在破碎上清中没有发现大小合适的蛋白,在破碎沉淀中发现大小合适的蛋白,推测可能诱导的蛋白形成了不溶性的包涵体,改变诱导条件,使目的基因在大肠杆菌中16℃过夜诱导,SDS-PAGE检测,在破碎上清中发现大小合适的可溶性蛋白,表达蛋白纯化后的浓度为770μg/ml,但是经活性测定,表达的蛋白没有木聚糖抑制活性,外且也几乎没有几丁质酶活性。(4)该基因在毕赤酵母中用0.5%甲醇于28℃诱导诱导12h后出现目的蛋白,诱导84h后,目的蛋白在毕赤酵母中表达量大约为19.52mg/ml,但是表达的蛋白仍然检测不到木聚糖酶抑制活性及几丁质酶活性。(5)目的基因诱导的蛋白仅从结构上属子几丁质酶,而没有几丁质酶活性,这一点符合本研究初始预测,但没有木聚糖酶抑制活性,因而没有得到本研究初始预测的结果。(6)原核诱导表达的蛋白与真核诱导表达的蛋白分子大小.致,略小于29.0kDa,表达的蛋白经软件计算分子量为26.017kDa,按迁移率计算分子量为28.79kDa,差异不大。